趙薇萍 ， 齊藝惠 ， 李晶晶，2 ， 宋爽 ， 翟睿 ， 杜茜茜

1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.北京市計量檢測科學研究院，北京 100029；3.中國計量科學研究院國家市場監(jiān)管技術創(chuàng)新中心（質(zhì)譜）前沿計量科學中心，北京 100029

巖藻多糖（fucoidan）又名巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠，主要來源于海參體壁和褐藻細胞壁等，是一類主要由L-巖藻糖和硫酸基團組成，并含有其他多種單糖（如半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖）的水溶性雜多糖［1］。研究表明，巖藻多糖具有多種生物活性，如抗炎［2］、抗腫瘤［3］、增加腸道益生菌豐度［4］、抗氧化［5］、免疫調(diào)節(jié)［6］、抗凝血［7］和抗病毒［8］等，其開發(fā)和利用備受關注，已被應用于醫(yī)藥和食品行業(yè)，并顯示出了廣闊的應用前景。

1，9-二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法常用于檢測酸性多糖含量，也是巖藻多糖定量檢測的方法之一，具有方便快速、操作簡單等優(yōu)勢［9］。DMMB是一種醌亞胺類陽離子染色劑，在酸性介質(zhì)中，亞甲基藍的雜環(huán)氮原子因質(zhì)子化而帶正電，以陽離子狀態(tài)存在，因此能夠與帶負電荷的巖藻多糖形成可溶于水的異染變色配合物，導致溶液的顏色發(fā)生變化［10-11］。目前，常用的DMMB檢測方法是將4 mL濃度為10.7 mg·mL-1、pH 3.3的DMMB顯色液與0.18 mL巖藻多糖待測溶液混勻后測定［12］。但是，該方法在巖藻多糖的實際檢測中，存在巖藻多糖樣品和顯色液用量較大、可檢測濃度范圍窄、靈敏度差、易受雜質(zhì)干擾等問題，影響了該方法的推廣應用，亟需進一步改良。

本研究對DMMB法的檢測條件進行了優(yōu)化，在保證檢測靈敏度和精密度的前提下，簡化了操作步驟，縮小了反應體系，節(jié)省了檢測時間，拓寬了線性范圍，以期為巖藻多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制和研究開發(fā)提供快捷可靠的定量分析檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料 巖藻多糖購自山東日照潔晶集團股份有限公司；DMMB購自Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自上海生工生物工程有限公司；巖藻糖標準品購自Fluka公司。

1.1.2 實驗設備 多功能酶標儀購自Tican公司；紫外可見分光光度計購自上海舜宇恒平科學儀器公司；0111DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購自鞏義市予華儀器有限責任公司；AIR troller通風櫥購自深圳朗飛氣流控制系統(tǒng)公司；Lambda 35紫外可見光譜儀購自PerkinElmer公司；XW-80A漩渦混合器購自上海精科有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外光譜測定 配制巖藻多糖-DMMB溶液，在室溫避光和不避光條件下放置0、10、20、30 min。以0.2 mL的去離子水為對照溶液。使用Lambda 35紫外-可見光譜儀在波長范圍為450～700 nm下進行掃描，測定樣品的紫外光譜變化。

1.2.2 DMMB溶液濃度的優(yōu)化 DMMB染色液濃度分別設置為10.7、21.4、32.1、42.8、53.5 mg·L-1。分別加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg·L-1巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標板中，再分別加入上述濃度的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。

1.2.3 DMMB溶液pH的優(yōu)化 確定DMMB染色液濃度，將pH分別設置為2.3、2.8、3.3、3.8、4.3。分別加入1.2.2中不同濃度的巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標板中，再分別加入上述不同pH的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。

1.2.4 其他物質(zhì)的影響 在巖藻多糖溶液中分別加入不同質(zhì)量的NaCl、乳清蛋白、魚膠原蛋白、海藻酸鈉，將其配成0、0.10、0.15、0.20、0.30 mg·mL-1雜質(zhì)-巖藻多糖溶液，混勻，取混合后溶液10 μL于96孔酶標板中，加入DMMB溶液，于525 nm處測吸光度值。

1.2.5 線性范圍的確定 分別加入0、0.0125、0.0250、0.0500、0.0625、0.0750、0.1000、0.1500、0.2000、0.2500、0.3000、0.3500、0.4000、0.5000 mg·mL-1巖藻多糖溶液10 μL于96孔酶標板中，加入42.8 mg·L-1、pH 3.3的DMMB溶液200 μL，振蕩，于525 nm處測吸光度值。標準曲線的相關系數(shù)大于0.99，表示具有良好的線性關系。

1.2.6 加標回收率實驗 取2種不同濃度的巖藻多糖樣品（樣品1、2中巖藻多糖濃度分別為0.033 mg·mL-1、0.018 mg·mL-1），加入2種不同水平的巖藻多糖標準品，按公式（1）測定其加標回收率（3個重復）。加標前后濃度均應在標準曲線線性范圍內(nèi)。

式中，P表示加入標準物質(zhì)的回收率（%）；X1表示加標樣品測定值（g），X0表示原樣品測出的含被測成分量（g），m表示加入標準物質(zhì)的質(zhì)量（g）。

1.2.7 精密度實驗 精確稱取6份巖藻多糖樣品，測定平行樣品間的巖藻多糖含量，計算相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）。組內(nèi)相對標準偏差不超過10%。

1.2.8 定量限和檢出限實驗 當信噪比達到S/N=10時，此時測出的樣品的最小濃度值為定量限。當信噪比達到S/N=3時，此時測出的樣品的最小濃度值為檢出限。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 實驗結果均以平均值±標準偏差表示，并采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為組間存在統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 DMMB溶液濃度的優(yōu)化

為了確定DMMB顯色法中顯色液的最佳濃度，本實驗對不同濃度DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值和線性范圍進行了檢測。實驗結果如圖1所示，當巖藻多糖樣品濃度在0～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)，DMMB顯色液的濃度增大至42.8 mg·mL-1和53.5 mg·mL-1時，該方法顯示出了良好的線性關系（R2≥0.99）。根據(jù)中國藥典相關規(guī)定［13］，使用紫外分光光度計測定樣品吸光度時，要求測得的吸光度在0.2～0.8之間，以保證定量檢測的靈敏度，縮小檢測誤差。因此，DMMB顯色液的最佳濃度為42.8 mg·mL-1。

圖1 DMMB顯色液濃度對標準曲線的影響Fig. 1 The effect of DMMB concentration on standard curve

2.2 DMMB溶液pH的優(yōu)化

本實驗使用2.1優(yōu)化出的最佳DMMB濃度（42.8 mg·mL-1）進一步確定DMMB顯色法中顯色液的最佳pH。通過改變DMMB顯色液的pH，觀察DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度和線性范圍，以確定最佳的顯色條件［14］。實驗結果如圖2所示，當巖藻多糖樣品濃度在0～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)，DMMB溶液pH為3.3、3.8和4.3時，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值顯示出了良好的線性關系（R2≥0.99）。由于DMMB溶液的pH為3.8和4.3，巖藻多糖樣品濃度大于0.25 mg·mL-1時，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值大于0.8，不能保證檢測的靈敏度和準確性。因此，最終選定DMMB顯色液的最佳pH為3.3。

圖2 DMMB溶液pH對標準曲線的影響Fig. 2 The effect of DMMB pH on standard curve

2.3 最佳測量波長的確定

為了確定檢測方法的最佳測量波長，研究光照對DMMB-巖藻多糖顯色液吸光度值的影響，本實驗使用不含巖藻多糖的DMMB溶液作為空白對照，在0～30 min時間范圍內(nèi)對避光和不避光的DMMB-巖藻多糖顯色液的紫外光譜進行檢測。實驗結果如圖3所示，DMMB-巖藻多糖顯色液與空白對照組在波長為525 nm處的紫外吸收差值最大，因此選定525 nm為DMMB-巖藻多糖顯色液的最佳測量波長，與劉紅英等［15］的結果一致。由實驗結果還可看出，在相同時間下，避光放置的顯色液的吸光度在525 nm處的降低程度明顯高于未避光的顯色液，因此，應在避光條件下完成DMMB-巖藻多糖顯色液的檢測。

2.4 最佳檢測時間的選擇

由于DMMB溶液和聚陰離子間的相互作用是可逆的，在實際的檢測過程中，隨著放置時間的延長，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值會逐漸降低［16-17］。為了確定最佳的檢測時間，本實驗在DMMB與巖藻多糖混合后的30 min內(nèi)，對顯色液的吸光度在525 nm處進行監(jiān)測。如圖4所示，隨著放置時間延長，DMMB-巖藻多糖顯色液的吸光度值呈明顯的降低趨勢。為了保證檢測的靈敏度和準確性，應盡快完成檢測。此外，為了將誤差控制在1%以內(nèi)，建議在巖藻多糖溶液與DMMB溶液混合后10～15 min完成吸光度檢測。

圖4 顯色液的吸光度變化Fig. 4 Absorbance change of chromogenic solution

2.5 方法學結果考察

本實驗采用改良后的DMMB法對不同濃度的標準品中巖藻多糖含量進行了線性范圍檢測，并選取2種樣品進行回收率和精密度考察。結果表明，在0.0125～0.3000 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)的標準工作曲線為y=1.3275x+0.443，R2=0.9913，其相關系數(shù)大于0.99，即顯示出了良好的線性關系。由表1可知，改良后的檢測方法加標回收率均符合2015年頒布的中國藥典［13］相關規(guī)定，即回收率在90%～108%以內(nèi)。2種樣品的組內(nèi)相對標準偏差均不超過10%。因此可證明改良后的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。改良后DMMB法的反應體系減小，可在節(jié)約巖藻多糖樣品的同時簡化實驗操作，節(jié)約檢測時間；其線性范圍較原方法的0～0.1 mg·mL-1相比，擴寬了3倍。

表1 回收率和精密度考察結果Table 1 The results of recovery and precision

2.6 雜質(zhì)對DMMB法檢測巖藻多糖的影響

在實際檢測過程中，巖藻多糖樣品中可能存在可溶性鹽、蛋白質(zhì)以及海藻酸鈉的干擾［18］。因此，本實驗考察了氯化鈉、海藻酸鈉、乳清蛋白和膠原蛋白這些巖藻多糖中常見雜質(zhì)對檢測結果的影響。如圖5A所示，氯化鈉濃度≤0.3 mg·mL-1時，不影響檢測結果。圖5B中，在海藻酸鈉濃度≤0.01 mg·mL-1時，其吸光度值沒有顯著性差異；而當樣品中海藻酸鈉濃度大于0.01 mg·mL-1時，其吸光度值明顯升高。這種現(xiàn)象是由于海藻酸鈉也是一種酸性多糖，在溶液中可以與DMMB發(fā)生特異性異染現(xiàn)象從而導致溶液的顏色變化，這與Richardson等［19］研究結果一致。因此，改進后的檢測方法幾乎不能排除海藻酸鈉雜質(zhì)的干擾，只可對低海藻酸鈉雜質(zhì)含量的樣品進行測定。如圖5C～D所示，向巖藻多糖樣品中分別添加不同含量的乳清蛋白和膠原蛋白后進行顯色反應，當樣品中膠原蛋白含量是巖藻多糖含量的2倍時，其最終測定的吸光度值沒有顯著性差異。由上述實驗結果可以看出，改良后的檢測方法可在樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量低于或等于巖藻多糖含量時，完成待測樣品中巖藻多糖含量的精確測量。超出該范圍可能會導致測量結果低于該樣品中巖藻多糖的實際含量。因此，改良后的檢測方法不會受樣品中氯化鈉雜質(zhì)的影響，而當樣品中乳清蛋白雜質(zhì)的添加量超過溶液中巖藻多糖含量的1倍（＞0.2 mg·mL-1）時，其吸光度值會有一定的降低。因此在采用DMMB法檢測巖藻多糖時，應預先除去海藻酸鈉，以免對實驗結果產(chǎn)生誤差。

圖5 雜質(zhì)對DMMB法檢測巖藻多糖的影響Fig. 5 The effects of impurities on DMMB method for determination of fucoidan

3 討論

巖藻多糖是一種具有多種生物活性的海洋活性多糖［20］。由于巖藻多糖來源廣泛，具有多種生物活性且易提取，有望被開發(fā)成為21世紀的新藥原料［21］。巖藻多糖含量是評價巖藻多糖產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標，現(xiàn)今常用的巖藻多糖定量檢測方法是DMMB顯色法和HPLC法。DMMB比色法是一種常用的檢測酸性多糖含量的方法，相比于HPLC法具有方便快速，操作簡單等優(yōu)勢，已被廣泛應用于酸性多糖的檢測中［22］。目前常用的DMMB檢測方法操作步驟復雜、線性范圍較窄（0～0.1 mg·mL-1）、精密度差、反應體系大，容易造成樣品的浪費，存在一定的局限性，不能實現(xiàn)巖藻多糖的快速定量檢測。因此，對現(xiàn)有定量檢測方法進行改良是十分必要的。本研究對DMMB法檢測巖藻多糖含量的方法條件進行了改良。與原方法相比，DMMB溶液濃度提升至42.8 mg·mL-1，在保持pH 3.3的同時，反應體系明顯減??；避光反應在10～15 min內(nèi)進行檢測，可在節(jié)約巖藻多糖樣品的同時，簡化實驗操作，節(jié)約檢測時間。該方法還將檢測的線性范圍擴寬至0.0125～0.3000 mg·mL-1，是原方法的3倍。除此之外，還對改良后的方法進行了方法學分析，結果表明改良后檢測方法的加標回收率在90%～108%之間，相對標準偏差均在10%以下，符合中國藥典的相關規(guī)定，滿足檢測要求。

綜上，本研究建立了一種簡便、快捷，可實現(xiàn)巖藻多糖含量快速檢測的方法。改良后的檢測方法能夠更好地滿足巖藻多糖高效定量的需求，助力巖藻多糖的產(chǎn)品質(zhì)量控制和研究開發(fā)，為巖藻多糖的進一步研究和開發(fā)奠定了理論基礎。本研究雖然對巖藻多糖的定量檢測方法進行了改良，具有較好的線性關系。然而，巖藻多糖提取過程中是否有其他雜質(zhì)會對后序測定產(chǎn)生干擾，仍需要進一步深入研究。