蔡楊,凌保東

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610500;2.成都醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610500;3.四川省彭州市第四人民醫(yī)院,彭州 611933)

雙組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system,TCS)廣泛存在于原核細(xì)胞中,是細(xì)菌感知和響應(yīng)環(huán)境信號(hào)、調(diào)節(jié)生理行為最主要的機(jī)制,在細(xì)菌致病性、耐藥性、生物被膜形成、毒力因子調(diào)控等方面均發(fā)揮著重要作用[1]。當(dāng)細(xì)菌TCS感知和響應(yīng)環(huán)境刺激時(shí),是通過(guò)組氨酸激酶(histidine kinases,HK)和胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulators,RR)使相關(guān)蛋白磷酸化來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用[2]。細(xì)菌蛋白質(zhì)磷酸化修飾是調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá)的一種重要方式,也是藥物作用的重要靶點(diǎn)。因此,靶向細(xì)菌TCS 抑制劑的開發(fā)成為新型抗感染藥物研究的熱點(diǎn)[3]。

1 TCS介紹

TCS是細(xì)菌、古細(xì)菌中最普遍的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[1],在細(xì)菌中共發(fā)現(xiàn)TCS 1 000多種,平均一個(gè)細(xì)菌基因組可包含TCS編碼基因50～60個(gè),如銅綠假單胞菌編碼TCS 60多個(gè),大腸埃希菌編碼TCS>30個(gè),鮑曼不動(dòng)桿菌中TCS有18個(gè)[4]。

1.1TCS 結(jié)構(gòu)和功能 TCS通常由2種成分組成,即嵌入細(xì)胞膜中傳感器HK和胞內(nèi)RR[5]。HK接受環(huán)境的刺激,RR引起相應(yīng)的生理改變[5],它們?cè)诩?xì)菌細(xì)胞中具有高度特異性[6]。HK由信號(hào)接收域和結(jié)構(gòu)保守的催化核心組成,催化核心包括蛋白二聚體和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(dimerization and histidine phosphotransfer,DHp) 和ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域[6]。RR由信號(hào)接收域和DNA結(jié)合的輸出結(jié)構(gòu)域組成[6]。

細(xì)菌TCS感知和響應(yīng)環(huán)境刺激時(shí),通過(guò)HK和RR使相關(guān)蛋白磷酸化來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。分為4個(gè)步驟:①HK檢測(cè)外部環(huán)境或胞內(nèi)/胞外生理性刺激,如滲透壓或 pH 值;②HK催化DHp上保守的組氨酸發(fā)生自身磷酸化;③磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到同源RR接收結(jié)構(gòu)域保守的天冬氨酸上;④磷酸化反應(yīng)激活RR與特定DNA序列的結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的控制[2,7]。許多HK也可以作為磷酸酶,使磷酸化的RR去磷酸化,從而可逆地控制基因表達(dá)。此外,復(fù)雜TCS信號(hào)傳導(dǎo)需要通過(guò)多步磷酸化接力傳遞來(lái)完成信號(hào)傳遞[3]。HK磷酸化后,磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)的一個(gè)接收結(jié)構(gòu)域上,然后由組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至RR上,再引發(fā)信號(hào)輸出,引起多種細(xì)胞生理變化[3]。在某些情況下,單個(gè) HK 蛋白可具有多個(gè)同源 RR 蛋白,或單個(gè) RR 蛋白可被多個(gè) HK 蛋白激活[8]。為了更敏感地響應(yīng)不同的環(huán)境變化,信息也在不同的 TCS之間傳遞,形成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),各TCS相互作用、互相協(xié)調(diào),感應(yīng)外界環(huán)境并做出應(yīng)答[7,9]。

細(xì)菌具有多個(gè)TCS,每個(gè)TCS響應(yīng)特定的環(huán)境信號(hào),如pH值、營(yíng)養(yǎng)水平、滲透壓、氧化還原狀態(tài)、群體感應(yīng)蛋白和抗菌藥物[10],由此產(chǎn)生的細(xì)胞生理變化通常涉及激活細(xì)菌防御機(jī)制和增加抗菌藥物耐藥性[11],功能包括細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝調(diào)節(jié)、趨化性、毒力調(diào)節(jié)、群體感應(yīng)、生物被膜形成和耐藥性產(chǎn)生等[2]。

1.2TCS的種類

1.2.1必需的TCS WalKR TCS已被證明在革蘭陽(yáng)性菌(包括枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌和糞腸球菌)的生長(zhǎng)中是必要的,功能主要為調(diào)節(jié)細(xì)胞壁代謝[12],但在革蘭陰性菌(肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌)中必需的TCS筆者未見報(bào)道。見表1。

表1 TCS種類及生理功能

1.2.2非必需的TCS 除了涉及生長(zhǎng)的TCS,大多數(shù) TCS 對(duì)正常生長(zhǎng)條件下的細(xì)菌存活不是必需的。細(xì)菌應(yīng)對(duì)特殊壓力環(huán)境的特定反應(yīng),如耐藥性、毒力調(diào)節(jié)與生物被膜的形成都依賴于非必需TCS。各種TCS參與并調(diào)節(jié)致病菌的毒力因子,包括毒素的產(chǎn)生和分泌,對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。其他重要的功能包括運(yùn)動(dòng)性、粘附宿主、定植和生物被膜形成等。見表1。

2 TCS與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系

2.1細(xì)胞表面修飾

2.1.1革蘭陰性菌 TCS PhoPQ和PmrAB通過(guò)上調(diào)負(fù)責(zé)修飾細(xì)菌膜中脂多糖脂質(zhì)A基因的表達(dá),在多種革蘭陰性菌(包括銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等)的多粘菌素和抗菌肽的耐藥性中起重要作用[4,18]。脂質(zhì)A修飾包括加入4-氨基阿拉伯核糖或磷酸乙醇胺,可降低細(xì)胞膜的凈負(fù)電荷,限制與陽(yáng)離子抗菌藥物(如多粘菌素)的相互作用。PhoPQ 可感知細(xì)菌胞外鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)和陽(yáng)離子抗菌肽的存在,PmrB感知環(huán)境中弱酸性、低鎂離子、鐵限制等信號(hào)[19]。PhoPQ參與沙門菌中毒力的控制,且在銅綠假單胞菌的生物被膜形成和毒力中發(fā)揮作用[4,20]。PhoPQ不存在鮑曼不動(dòng)桿菌中,PmrAB獨(dú)立參與鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素的耐藥性[13]。肺炎克雷伯菌的PhoBR調(diào)節(jié)編碼孔蛋白基因phoE表達(dá)下調(diào),介導(dǎo)碳青霉烯類藥物的耐藥性[21]。

2.1.2革蘭陽(yáng)性菌 TCS VraSR能夠?qū)Π邢蚣?xì)胞壁肽聚糖合成的抗菌藥物迅速做出反應(yīng),感知細(xì)胞壁損傷,阻礙細(xì)胞壁合成基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng),導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類和糖肽類抗菌藥物耐藥,并且調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒力和生物被膜的形成[22]。VraS或VraR基因的缺失會(huì)使金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物和萬(wàn)古霉素重新敏感[23],并且在調(diào)節(jié)表皮葡萄球菌生物被膜的形成和對(duì)壓力的耐受性中也起著重要作用[24]。WalKR不僅參與細(xì)胞壁合成的調(diào)控,還與lytM、atlA、ssaA和isaA基因的啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合,正向調(diào)控自溶素和肽聚糖水解酶的表達(dá),修飾細(xì)胞壁表面結(jié)構(gòu),增加萬(wàn)古霉素耐藥性[12]。BraRS參與檢測(cè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞,對(duì)桿菌肽和乳鏈菌肽的耐藥至關(guān)重要[22]。

2.2外排泵的過(guò)度表達(dá) AdeRS是鮑曼不動(dòng)桿菌中研究最深入的TCS之一。AdeRS中AdeR、AdeS或兩者共同突變導(dǎo)致外排泵AdeABC過(guò)表達(dá)[25],介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌的替加環(huán)素耐藥性[25]。當(dāng)adeS失活,RND外排泵AdeABC顯現(xiàn)下調(diào)而導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基苷類藥物的敏感性增加[26]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),AdeRS控制近579個(gè)不同基因的表達(dá)[27]。此外,AdeRS也調(diào)控生物被膜的形成和表面運(yùn)動(dòng)相關(guān)功能[28]。鮑曼不動(dòng)桿菌的TCS BaeSR通過(guò)上調(diào)外排泵基因adeA和adeB增加替加環(huán)素耐藥性[29]。BaeSR 的缺失可導(dǎo)致主要外排泵 AdeABC、AdeIJK 和 MacAB-TolC 表達(dá)顯著降低,增加鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素和鞣酸的敏感性[30-31]。AdeRS 和BaeSR的耐藥機(jī)制重疊,提示BaeSR可能通過(guò)與AdeRS發(fā)生串繞,共同調(diào)控基因表達(dá)[30]。CpxAR可以控制外排泵編碼基因acrB、acrD和eefB的表達(dá),與頭孢吡肟和氯霉素耐藥性有關(guān)[32];最新研究表明,當(dāng)移動(dòng)元件ISAba1插入BaeSR 基因后,外排泵基因(如macAB和adeIJK)表達(dá)增強(qiáng),并介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素的耐藥[33]。

2.3激活耐藥酶 銅綠假單胞菌中TCS CreBC激活染色體ampC基因,引發(fā)染色體β-內(nèi)酰胺酶的過(guò)量產(chǎn)生,水解 β-內(nèi)酰胺類藥物[34]。GluSR突變也可以激活伯克霍爾德菌的β-內(nèi)酰胺酶引起β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[35]。PhoPQ 失活改變嗜麥芽窄食單胞菌外膜通透性,并增加β-內(nèi)酰胺酶的流入,導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[36]。氣單胞菌中TCS BlrAB通過(guò)BlrB 感知肽聚糖損傷使BlrA磷酸化,導(dǎo)致幾種β-內(nèi)酰胺酶的激活,包括頭孢菌素酶、青霉素酶和碳青霉烯酶[37]。AarG傳感器激酶通過(guò)調(diào)節(jié)aac(2')-Ia基因,導(dǎo)致氨基苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增加,與氨基苷類抗菌藥物耐藥性有關(guān)[38]。

2.4形成生物被膜 細(xì)菌生物被膜形成受TCS密切調(diào)控,TCS 控制生物被膜產(chǎn)生的關(guān)鍵成分以響應(yīng)環(huán)境刺激,并最終觸發(fā)細(xì)菌從浮游菌階段轉(zhuǎn)變?yōu)樯锉荒ぞA段[39]。一旦形成生物被膜,細(xì)菌通過(guò)TCS或群體感應(yīng)系統(tǒng)再次激活生物被膜內(nèi)其他毒力基因[40]。銅綠假單胞菌多個(gè)TCS參與其生物被膜形成的整個(gè)過(guò)程,包括粘附-不可逆附著-聚集-成熟-解聚,涉及SagS、CreBC、GacSA等多個(gè)TCS[39,41-42]。SagS 激活 BrlR 上調(diào)MDR 外排泵,大大提高生物被膜的耐藥性[41];CreBC直接感知青霉素結(jié)合蛋白4(PBP4),增加生物被膜的形成[42]。GacSA 通過(guò)與 RetS 和 LadS 的相互作用來(lái)控制sRNA、RsmY 和 RmsZ 的表達(dá),將細(xì)菌急性感染轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥綶39]。除了調(diào)控生物被膜的形成,TCS在銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)性、毒素分泌和色素產(chǎn)生中都起重要作用。鮑曼不動(dòng)桿菌通過(guò)激活BfmRS促進(jìn)菌毛組裝系統(tǒng)CsuA/BABCDE表達(dá),合成菌毛粘附于生物/非生物的表面[43-44]。敲除BfmR后塑料上生物被膜形成的喪失,導(dǎo)致美羅培南和多黏菌素E耐藥性上升。BfmS敲除后生物被膜形成受損,且減少Hcp蛋白的分泌[45],對(duì)氨曲南和多黏菌素敏感性降低[46]。GacSA在鮑曼不動(dòng)桿菌中可以視為全局性調(diào)控劑,控制著多種基因的表達(dá),包括毒力基因、菌毛、生物被膜形成以及運(yùn)動(dòng)性和芳香化合物代謝[39]。

3 TCS抑制劑

細(xì)菌TCS的主要調(diào)控方式是蛋白質(zhì)磷酸化修飾,它既是調(diào)控細(xì)菌細(xì)菌諸多生命活動(dòng)的一種重要方式,也是藥物作用的重要靶點(diǎn)[9,47]。目前靶向細(xì)菌TCS的藥物主要作用于TCS的HK-RR結(jié)構(gòu)域而影響其生物學(xué)功能,涉及到的具體靶點(diǎn)主要有:①阻斷HK對(duì)外部刺激的識(shí)別;②抑制HK磷酸化;③抑制ATP結(jié)合;④抑制RR磷酸化;⑤抑制RR與DNA結(jié)合[48]。根據(jù)TCS來(lái)源,將TCS抑制劑分為三大類:小分子化合物類TCS抑制劑、天然產(chǎn)物類TCS抑制劑和抗菌肽類TCS抑制劑。

3.1小分子化合物類TCS抑制劑

3.1.1靶向組氨酸激酶HK的抑制劑 迄今為止,大多數(shù)報(bào)道的TCS小分子抑制劑主要作用于TCS的HK。HK的催化結(jié)構(gòu)域在TCS結(jié)構(gòu)中保守度高,故大多抑制劑都以HK為靶點(diǎn)。最早在1993年報(bào)道的TCS抑制劑是合成的噻唑衍生物,可以同時(shí)抑制銅綠假單胞菌HK AlgR2活性和RR AlgR1與DNA結(jié)合活性[49]。環(huán)苯、苯并咪唑、苯并葉惡嗪、雙苯等小分子化合物,不僅抑制HK,且影響細(xì)胞膜的完整性[48]。近年來(lái)以苯并噻唑?yàn)閮?nèi)核的小分子化合物成為研究熱點(diǎn),GOSWAMI等[50]通過(guò)高通量篩選鑒定的類似物riluzole-4 和riluzole-12通過(guò)阻斷TCS GacS/GacA的信號(hào)影響RR GacA的表達(dá)降低喹諾酮類和吩嗪類等毒力因子的產(chǎn)生,并嚴(yán)重影響銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)性。THIELEN等[51]合成的2-氨基苯并噻唑類抑制劑在低Mg2+下抑制腸道沙門菌的生長(zhǎng),降低毒力基因pagC和pagK的表達(dá),并減弱對(duì)多粘菌素B和多粘菌素E耐藥性,使多粘菌素B和多粘菌素E的MIC降低至少16倍。

3.1.2靶向反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白R(shí)R的抑制劑 相較于靶向HK,靶向RR最大的優(yōu)勢(shì)是直接控制基因表達(dá),從而控制細(xì)菌的生理行為。在非同源HK-RR對(duì)之間可能發(fā)生不同程度的串?dāng)_,RR可以被來(lái)自另一個(gè)TCS的HK磷酸化,例如抑制同源HK會(huì)導(dǎo)致RR功能的不完全抑制[52]。TSAI等[53]鑒定的化合物Dephostatin通過(guò)SsrA-SsrB和PmrB-PmrA雙組分調(diào)控系統(tǒng)干擾信號(hào)傳導(dǎo),可抑制沙門菌細(xì)胞內(nèi)毒力因子并恢復(fù)多粘菌素的敏感性。TCS ArsRS對(duì)于幽門螺桿菌的酸適應(yīng)和胃內(nèi)定植至關(guān)重要,同時(shí)控制幽門螺桿菌主要毒力因子的表達(dá),包括粘附因子和生物被膜[54]。

3.2天然產(chǎn)物類TCS抑制劑 近年來(lái),發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的天然產(chǎn)物具有TCS抑制活性,很多天然藥物中已經(jīng)分離出包括酚類、黃酮類、萜類等多種具有TCS抑制活性的中藥單體化合物[55]。ZHOU等[56]驗(yàn)證木犀草素對(duì)HK853蛋白自磷酸化活性的抑制作用,且木犀草素對(duì)HKS53的結(jié)合和抑制并非特異性,該作用可以推廣到其他結(jié)構(gòu)類似于木犀草素的黃酮類物質(zhì)和TCS的其他HK蛋白。GONZALEZ等[57]證明7種天然類黃酮(包括木犀草素、山奈酚、槲皮素、楊梅素、芹菜素、白楊素和橙皮素)明顯抑制HsrA的DNA結(jié)合活性,其中芹菜素、白楊素、山奈酚和橙皮素表現(xiàn)出對(duì)幽門螺桿菌的殺菌活性,白楊素與克拉霉素或甲硝唑組合表現(xiàn)出協(xié)同抗菌活性。兩者的研究表明,黃酮類天然產(chǎn)物可作用于TCS不同靶點(diǎn),進(jìn)一步證明了黃酮類天然產(chǎn)物作為新型TCS抑制劑的潛力。

3.3抗菌肽類TCS抑制劑 抗菌肽對(duì)TCS的抑制主要表現(xiàn)為靶向胞內(nèi)的RR受體和競(jìng)爭(zhēng)性抑制HK。HO等[58]發(fā)現(xiàn)抗菌肽乳鐵素B降低大腸埃希菌對(duì)環(huán)境刺激的耐受性,通過(guò)選擇性結(jié)合RR受體結(jié)構(gòu)域,抑制RR(BasR和CreB)及其同源HK(BasS和CreC)的磷酸化,表明抗菌肽可以直接影響TCS的磷酸化來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。能力刺激肽(CSP)是由肺炎鏈球菌分泌的 17 個(gè)氨基酸小分子肽。當(dāng)CSP的濃度達(dá)到閾值時(shí),CSP通過(guò)結(jié)合HK Com D ,激活RR ComE,導(dǎo)致毒力因子的表達(dá)[59]。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾小分子肽可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制CSP,在肺炎鏈球菌肺部感染期間可有效地與HK ComD結(jié)合,抑制RR ComE調(diào)節(jié)基因的表達(dá),降低了小鼠死亡率[60]。這種小分子肽可作為治療肺炎球菌感染的新一代抗菌劑。

3種類型TCA抑制劑舉例見表2。

表2 TCS抑制劑舉例

4 結(jié)束語(yǔ)

細(xì)菌通過(guò)TCS的蛋白質(zhì)磷酸化修飾方式調(diào)控細(xì)菌生命活動(dòng);可以通過(guò)干擾TCS通路來(lái)開發(fā)的新型抗菌藥物 。按作用靶點(diǎn)分類,TCS抑制劑可以分為靶向HK和靶向RR以及同時(shí)靶向HK和RR的藥物。靶向抑制HK活性的藥物,可以減少磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移,影響細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生;靶向抑制RR活性的藥物,特異性強(qiáng),直接控制基因表達(dá);同時(shí)靶向抑制HK和RR的藥物表現(xiàn)出高度的疏水性,生物利用度較差。由于TCS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)僅存在于原核細(xì)胞,開發(fā)的TCS抑制劑對(duì)人體細(xì)胞影響較小。通過(guò)靶向TCS來(lái)設(shè)計(jì)具有抗菌活性的小分子化合物抑制劑,研發(fā)周期長(zhǎng)、投資大,目前尚沒有小分子化合物被開發(fā)成為臨床用藥。天然產(chǎn)物便宜易得,且具有一定的抗菌活性,這一類TCS抑制劑可以作為聯(lián)合用藥治療耐藥菌感染,既增強(qiáng)抗菌藥物的抗菌作用效果,還可較大限度地減少耐藥性的產(chǎn)生。部分抗菌多肽也可以影響細(xì)菌的蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程,可以作為TCS抑制劑。但天然抗菌肽存在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性差、活性普遍不高和存在細(xì)胞毒性等缺陷。針對(duì)耐藥菌引起的感染,TCS抑制劑具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景,與常規(guī)藥物聯(lián)合用藥或?qū)⒊蔀榻鉀Q抗菌藥物耐藥性問(wèn)題的新策略。