段夢(mèng)園,沈敏,和儀,葉菜英,朱蕾

[1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥理系,北京 100005;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(NCRC-DID),疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730]

自身炎癥性疾病(autoinflammatory diseases,AIDs)是近年被逐漸認(rèn)識(shí)的一組罕見風(fēng)濕免疫病,主要是由于編碼炎癥通路關(guān)鍵分子的基因突變引起固有免疫失調(diào),最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)系統(tǒng)性或器官炎癥反應(yīng)。其主要特征為反復(fù)或持續(xù)炎癥(急性期反應(yīng)物升高),較常見的臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、皮疹、漿膜炎、淋巴結(jié)腫大和關(guān)節(jié)炎等[1-3]。與自身免疫性疾病不同,AIDs缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要致病作用(自身反應(yīng)性T細(xì)胞或自身抗體產(chǎn)生)[1]。據(jù)關(guān)鍵性致病細(xì)胞因子和失調(diào)炎癥通路,可將AIDs分為白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β介導(dǎo)疾病、干擾素介導(dǎo)自身炎癥綜合征、肉芽腫性疾病、補(bǔ)體疾病和其他類[1-2]。

IL-1β介導(dǎo)AIDs是最早被認(rèn)識(shí)的一類AIDs,包括家族性地中海熱(familial Mediterranean fever,FMF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體相關(guān)周期性綜合征(TNF receptor-associated periodic syndrome,TRAPS)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白12(NLRP12)相關(guān)自身炎癥性疾病(NLRP12-associated autoinflammatory disease,NLRP12-AID)和甲羥戊酸激酶缺乏癥(mevalonate kinase deficiency,MKD)等[1-2]。以往秋水仙堿和糖皮質(zhì)激素是治療IL-1β介導(dǎo)AIDs的常用藥物,但這兩類藥物并非特異性治療,部分患者無效,且長期使用不良反應(yīng)較多。隨著炎癥小體調(diào)控IL-1β作用的揭示,對(duì)IL-1β介導(dǎo)AIDs發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究起到極大促進(jìn)作用,生物制劑(包括IL-1抑制劑、TNF-α抑制劑以及IL-6抑制劑)顯示出良好的應(yīng)用前景,但其價(jià)格昂貴,長期使用有誘發(fā)感染和腫瘤的風(fēng)險(xiǎn),且IL-1抑制劑尚未在國內(nèi)上市[4-5]。因此,迫切期望開發(fā)出對(duì)于AIDs有效的新型治療藥物。

羧胺三唑(carboxyamidotriazole,CAI)是一種非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物,近年研究發(fā)現(xiàn)其具有良好抗炎作用,可抑制多種模型的急、慢性炎癥[6-10]。尤其是在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型以及結(jié)腸炎動(dòng)物模型中,CAI能夠降低炎癥小體活化,減少細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[9-10]。鑒于臨床對(duì)IL-1β介導(dǎo)AIDs的治療需求,本研究觀察CAI對(duì)NLRP12-AID、FMF、TRAPS等3種IL-1β介導(dǎo)AIDs患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影響,初步評(píng)價(jià)CAI治療IL-1β介導(dǎo)AIDs的可行性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1—7月在北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的3例NLRP12-AID患者、2例FMF患者以及1例TRAPS患者。臨床資料見表1。患者無伴發(fā)其他AIDs、自身免疫性疾病或其他系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(002-2018),患者均簽署知情同意書。

表1 3種IL-1β介導(dǎo)的自身炎癥性疾病患者臨床資料

1.2藥物與試劑 CAI由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成,純度>99.9 %,用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配置成40 mmol·L-1貯存液,保存于-20 ℃冰箱,臨用前用DMEM(高糖)培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。淋巴細(xì)胞分離液(德國GE Healthcare公司,貨號(hào):17-1140-02);DMSO(美國Amresco公司,貨號(hào):0231);胎牛血清(澳大利亞Gibco公司,貨號(hào):10270-106);DMEM(高糖)培養(yǎng)基和雙抗(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);人IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒[依科賽生物科技(太倉)有限公司]。

1.3儀器 低溫高速離心機(jī)(湖南可成設(shè)備有限公司),Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司),Synergy H1酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.4方法

1.4.1PBMCs分離和培養(yǎng) AIDs患者外周靜脈血采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心,獲到PBMCs。然后用含10%胎牛血清和0.5%雙抗的DMEM(高糖)培養(yǎng)基在37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4.2PBMCs給藥和指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組:NLRP12-AID患者和FMF患者PBMCs分為空白對(duì)照組和CAI各處理組(終濃度分別為10,20和40 μmol·L-1);TRAPS患者PBMCs分為空白對(duì)照組和CAI處理組(終濃度為40 μmol·L-1)。細(xì)胞培養(yǎng)22 h。

1.4.3細(xì)胞上清細(xì)胞因子 收集培養(yǎng)22 h后的上清液,采用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量,具體按試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處讀取各孔吸光度(A)值,并按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)濃度值。

2 結(jié)果

2.1CAI對(duì)NLRP12-AID患者PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響 與空白對(duì)照組比較,CAI(10、20和40 μmol·L-1)明顯降低NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β的水平(P<0.05或P<0.01)。CAI 3個(gè)濃度對(duì)IL-6和TNF-α的分泌水平有降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

①與空白對(duì)照組比較,t=1.852,P<0.05;②與空白對(duì)照組比較,t=8.242,8.739,P<0.01。

2.2CAI對(duì)FMF患者PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響 鑒于2例FMF患者在基礎(chǔ)水平(未作處理的空白對(duì)照組)的細(xì)胞因子分泌水平差距較大,因此對(duì)2例患者分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果見圖2。40 μmol·L-1CAI降低FMF患者ⅠPBMCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01),10和20 μmol·L-1CAI亦降低IL-6水平(P<0.01);3個(gè)濃度CAI均可降低FMF患者ⅡPBMCs分泌IL-1β水平(P<0.01),40 μmol·L-1CAI亦降低TNF-α的分泌水平(P<0.05),CAI對(duì)IL-6的分泌水平有所降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

①與空白對(duì)照組比較,t=2.654～4.831,P<0.05;②與空白對(duì)照組比較,t=2.469～10.940,P<0.01。

2.3CAI對(duì)TRAPS患者PBMCs分泌促炎細(xì)胞因子的影響 CAI(40 μmol·L-1)降低患者PBMCs分泌IL-1β水平(P<0.05),對(duì)IL-6水平有降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

①與空白對(duì)照組比較,t=5.299,P<0.05。

3 討論

IL-1β介導(dǎo)AIDs之前被稱為周期性發(fā)熱綜合征,以周期性發(fā)作性發(fā)熱伴局部炎癥為主要特征。基因檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步揭示炎癥小體活化導(dǎo)致IL-1β產(chǎn)生增多是此類疾病的核心發(fā)病機(jī)制[1-5]。炎癥小體是一類細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物,由NOD樣受體(Nod-like receptor,NLR)、銜接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和效應(yīng)分子caspase-1組成,激活后可將IL-1β前體(pro-IL-1β)、pro-IL-18切割為成熟形式以及誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。炎癥小體信號(hào)通路相關(guān)基因突變后可導(dǎo)致其過度激活,產(chǎn)生過量IL-1β,引起相關(guān)AIDs[11]。

NLRP12-AID又稱家族性寒冷性自身炎癥綜合征2(familial cold autoinflammatory disease 2,FCAS2),是一種常染色體顯性遺傳性AID,主要臨床癥狀包括反復(fù)發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎和肌痛等[3,12]。

NLRP12-AID的致病基因是NLRP12,其編碼蛋白NLRP12是形成炎癥小體的NLR家族成員之一。NLRP12基因突變不僅通過持續(xù)激活炎癥小體進(jìn)一步活化caspase-1,促進(jìn)pro-IL-1β的剪切和成熟,還可減弱NLRP12對(duì)NF-κB信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,從而導(dǎo)致以IL-1β為主的大量促炎細(xì)胞因子的分泌[12]。研究證實(shí),NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β和IL-6的水平分別是健康對(duì)照PBMCs的80～175倍和43～110倍[13]。因此在臨床治療上,IL-1β的靶向治療效果良好,可迅速改善患者癥狀[12,14-15]。本研究顯示,CAI(10、20和40 μmol·L-1)可以劑量依賴性降低NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β的水平,且對(duì)IL-6和TNF-α的分泌水平有降低趨勢(shì),故提示CAI可能對(duì)NLRP12-AID具有治療作用。

FMF是世界范圍內(nèi)最常見的AID[3],筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)FMF亦是中國人群中常見的AID[16],典型臨床表現(xiàn)包括反復(fù)發(fā)作的發(fā)熱、漿膜炎導(dǎo)致胸腹痛、關(guān)節(jié)腫痛等,由血清淀粉樣蛋白A引起的系統(tǒng)性AA淀粉樣變是主要的并發(fā)癥[1,16]。FMF是一種與MEFV基因突變有關(guān)的常染色體隱性遺傳性疾病,MEFV基因編碼的炎素蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ASC,從而減少NLRP3與ASC分子結(jié)合,抑制NLRP3炎癥小體的形成。由于MEFV基因突變會(huì)引起炎素蛋白數(shù)量減少或功能改變,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體過度激活,從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。秋水仙堿是FMF的最主要治療方法,可阻止60%患者發(fā)作,但長期使用會(huì)產(chǎn)生較多不良反應(yīng),尤其對(duì)兒童患者的生長發(fā)育可產(chǎn)生較大不良影響。IL-1抑制劑在秋水仙堿抵抗的患者中顯示出良好療效,卡納單抗(一種IL-1抑制劑)已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于FMF治療[4,17]。亦有使用TNF-α抑制劑和IL-6抑制劑有效的報(bào)道[4]。IL-6抑制劑還可成功治療繼發(fā)于FMF的淀粉樣變患者[4,18]。本研究發(fā)現(xiàn),給予CAI處理 對(duì)2例FMF患者PBMCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平有不同程度的降低作用,提示CAI可能對(duì)FMF具有治療作用。

TRAPS是一種常染色體顯性遺傳AID,臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱、皮疹、腹痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛/炎、眶周水腫和結(jié)膜炎等[1,3]。TRAPS發(fā)病與編碼Ⅰ型TNF受體(TNF receptor type Ⅰ,TNFR1)的TNFRSF1A基因突變相關(guān)。TNFR1可從細(xì)胞膜脫落成為游離態(tài),結(jié)合TNF-α從而抑制其活性;TNFRSF1A基因突變導(dǎo)致TNFR1錯(cuò)誤折疊從而脫落減少,與TNF-α的結(jié)合變少,更多的TNF-α與細(xì)胞表面受體結(jié)合,進(jìn)而活化下游NF-κB通路,產(chǎn)生大量細(xì)胞因子[2]。秋水仙堿對(duì)于預(yù)防 TRAPS反復(fù)發(fā)生無效;糖皮質(zhì)激素短期應(yīng)用可有效終止發(fā)作,但長時(shí)間使用可能出現(xiàn)耐藥并產(chǎn)生不良反應(yīng)。依那西普(TNF-α受體-抗體融合蛋白)對(duì)部分TRAPS患者有效,但有效性隨時(shí)間逐漸降低。不推薦使用抗 TNF 單克隆抗體(如英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗)治療,因其可能使部分患者癥狀加重。此外,亦有 IL-6抑制劑成功應(yīng)用的報(bào)道[4]。研究顯示,細(xì)胞內(nèi)積聚的錯(cuò)誤折疊TNFR1可引起活性氧產(chǎn)生和抑制自噬,從而激活NLRP3炎癥小體[5,19],IL-1抑制劑對(duì)于控制TRAPS的臨床癥狀具有良好和持久的作用,這亦支持該研究結(jié)果。卡納單抗被美國FDA批準(zhǔn)用于TRAPS治療,然而,卡納單抗組患者出現(xiàn)不良事件和嚴(yán)重不良事件的數(shù)量明顯高于安慰劑組[4,17]。本研究發(fā)現(xiàn),CAI對(duì)TRAPS患者PBMCs分泌的較高IL-1β有明顯降低作用,因此提示CAI可能對(duì)TRAPS具有治療作用。

綜上所述,本研究顯示CAI對(duì)NLRP12-AID、FMF和TRAPS等3種IL-1β介導(dǎo)AIDs患者PBMCs分泌IL-1β水平均具有顯著抑制作用,對(duì)IL-6和TNF-α的分泌亦具有不同程度的降低。后續(xù)將嘗試建立此3種AIDs的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型,進(jìn)一步明確CAI的療效。筆者近期揭示了炎癥小體活化在另一種AID——成人斯蒂爾病(adult-onset Still's disease,AOSD)中的致病機(jī)制,CAI通過抑制炎癥小體從而發(fā)揮對(duì)AOSD 的治療作用[20]。鑒于CAI在多項(xiàng)抗腫瘤臨床試驗(yàn)中顯示較輕的不良反應(yīng)和較好的耐受性[9],因此其具有應(yīng)用于IL-1β介導(dǎo)AIDs治療的巨大潛力。CAI亦能夠降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中以及三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中炎癥小體的活化[9-10],這可能是其治療IL-1β介導(dǎo)AIDs的潛在機(jī)制,尚需進(jìn)一步探究。此外,AIDs屬罕見病,本研究納入的患者樣本數(shù)量有限,且患者間存在個(gè)體差異,每例患者攜帶的基因突變型不同,病情輕重程度不同。后續(xù)研究中將擴(kuò)大病例數(shù)以及納入其他IL-1β介導(dǎo)AIDs患者樣本,并從CAI抑制炎癥小體途徑深入研究其治療機(jī)制,這將為IL-1β介導(dǎo)AIDs的治療提供新的途徑。