唐穎馨,姚達(dá)寶,聶璐薇,劉娜

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430030)

隨著人口的增長和老齡化,腦卒中成為全球人類致殘和死亡的第2大原因[1]。糖尿病是腦血管病危險(xiǎn)因素之一,約1/3腦卒中患者同時(shí)患有糖尿病,伴發(fā)糖尿病的腦卒中患者預(yù)后較差[2]。預(yù)防糖尿病、管理好糖尿病患者的血糖,對(duì)降低腦卒中的發(fā)生率、改善腦卒中患者的預(yù)后具有重要的臨床意義[3-5]。糖尿病屬于中醫(yī)的消渴病范疇[6],其治療需針對(duì)病因病機(jī),抓住陰虛為本的實(shí)質(zhì),以氣陰兩虛為主要治療對(duì)象,并兼顧陽虛與血瘀的治療為綱[7-8]。養(yǎng)陰益氣膠囊則是針對(duì)這一治法治則而開發(fā)的中藥新藥,處方組成為黃芪、葛根、山楂、絞股藍(lán)、天花粉、葫蘆巴,以“益氣養(yǎng)陰為主,兼及溫陽與活血”為治則,增強(qiáng)養(yǎng)陰之力,又改善脾胃之功,具有益氣養(yǎng)陰,兼顧治療陽虛與血瘀的作用,對(duì)上、中、下三消的病證有明確的功效。從單味藥材來看,本品大部分藥材均具有一定的降血糖作用[9-12],由于伴發(fā)糖尿病的腦卒中患者多有陰虛與血瘀表現(xiàn),因此養(yǎng)陰益氣膠囊對(duì)于腦卒中伴糖尿病患者的療效可能更好。養(yǎng)陰益氣膠囊作為中藥新藥,尚處于臨床前研究。因本品內(nèi)容物含有較多的輔料,開展毒理實(shí)驗(yàn)時(shí),采用最大灌胃量給藥也無法達(dá)到足夠的毒性考察劑量,故本研究采用其浸膏進(jìn)行灌胃給藥,以提高給藥量,連續(xù)給藥6個(gè)月來考察本品的長期毒性[13],以確定其安全劑量,為產(chǎn)品臨床安全應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠90只,6～8周齡,雌雄各半,雌性體質(zhì)量(146.9±8.9)g,雄性體質(zhì)量(171.4±13.4)g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字19-008)。大鼠按性別分籠飼養(yǎng),每籠5只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由進(jìn)水,保持室溫(25±2)℃,相對(duì)濕度55%～60%,12 h光照/12 h黑暗;大鼠喂養(yǎng)飼料(玉米73.5%,麥麩20%,魚粉5%,谷粉1%,食鹽0.5%)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物與溶媒 養(yǎng)陰益氣膠囊浸膏(浸膏1 g相當(dāng)于生藥6.64 g),由健民藥業(yè)股份有限公司提供,每瓶400 g,批號(hào):980920。溶媒為純化水,臨用前配制成不同濃度的混懸液。

1.3儀器 PRACTUM612-1CN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,感量:10 mg],XT-2000i全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀[希森美康生物科技(無錫)有限公司],AU680型全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼庫爾特有限公司),DM2500光學(xué)顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.4動(dòng)物分組與給藥 動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠隨機(jī)分為養(yǎng)陰益氣膠囊大劑量組、小劑量組和空白對(duì)照組,每組30只,雌雄各半。養(yǎng)陰益氣膠囊大劑量組:每日灌胃給藥劑量為相當(dāng)于生藥20 g·kg-1,相當(dāng)于臨床日擬用量的60倍;養(yǎng)陰益氣膠囊小劑量組:每日灌胃給藥劑量相當(dāng)于生藥5 g·kg-1,相當(dāng)于臨床日擬用量的15倍;空白對(duì)照組:每日灌胃等容量的純化水。各組均每日上午灌胃給藥1次,灌胃容量均為5 mL·kg-1;給藥劑量根據(jù)每周體質(zhì)量測量的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整;給藥時(shí)間均為180 d。給藥第90天時(shí),處死大劑量組和空白對(duì)照組動(dòng)物各10只,用于中間剖檢,以觀察灌胃90 d后動(dòng)物是否存在明顯毒性作用;給藥第180天時(shí),處死空白對(duì)照組和大劑量組動(dòng)物各10只,小劑量組20只;其余動(dòng)物停藥觀察2周后處死,處死前稱定體質(zhì)量。

1.5動(dòng)物基本情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間,每日觀察大鼠外觀體征、進(jìn)食、行為活動(dòng)、排便等情況;每周測量體質(zhì)量1次,統(tǒng)計(jì)分析每4周體質(zhì)量增長量。

1.6血液學(xué)指標(biāo)檢測 動(dòng)物處死后,取全血檢測紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白定量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類等。

1.7血液生化指標(biāo)檢測 動(dòng)物處死后,取全血,檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、血糖(glucose,Glu)等。

1.8病理檢查 ①系統(tǒng)尸檢:全面檢查各組織器官的大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、有無出血、淤血、滲出等病理變化。②臟器系數(shù):大鼠處死前稱定體質(zhì)量,取出心、肝、脾、肺、腎、胃、腎上腺、腦垂體、甲狀腺、卵巢、睪丸等組織后,立即用濾紙吸干表面水分,稱定質(zhì)量,計(jì)算臟器系數(shù)。③組織學(xué)檢查:10%甲醛(福爾馬林)溶液固定,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察。

1.9可逆性觀察 給藥180 d后,每組均留大鼠10只,于停藥后繼續(xù)觀察2周再處死,各項(xiàng)檢測指標(biāo)同前。

2 結(jié)果

2.1對(duì)動(dòng)物基本情況的影響 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間和停藥2周后,外觀體征和行為活動(dòng)未見異常,大鼠活動(dòng)自如,毛發(fā)整齊而有光澤,糞便呈顆粒狀;養(yǎng)陰益氣膠囊大、小劑量組大鼠體質(zhì)量增加,與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),大鼠體質(zhì)量增長情況見表1。

表1 3組大鼠不同給藥時(shí)間體質(zhì)量增長情況比較

2.2對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響 3組大鼠連續(xù)灌胃給藥180 d后,養(yǎng)陰益氣膠囊小劑量組和大劑量組血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)[12],與空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);停藥2周后,養(yǎng)陰益氣膠囊小、大劑量組血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 3組大鼠給藥180 d和停藥2周后血常規(guī)指標(biāo)比較

2.3對(duì)血生化指標(biāo)的影響 養(yǎng)陰益氣膠囊連續(xù)灌胃給藥180 d后,養(yǎng)陰益氣膠囊大劑量組BUN高于空白對(duì)照組(P<0.05),但仍在正常范圍內(nèi)[14];其余血生化指標(biāo)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);停藥2周后,與空白對(duì)照組比較,養(yǎng)陰益氣膠囊小劑量組、大劑量組血液生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 3組大鼠給藥180 d和停藥2周后血生化指標(biāo)比較

2.4對(duì)臟器系數(shù)的影響 系統(tǒng)尸解發(fā)現(xiàn),給藥180 d和停藥2周,3組大鼠各組織器官的大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地等均未見異常,無水腫、出血、滲出等變化。養(yǎng)陰益氣膠囊連續(xù)灌胃給藥180 d和停藥2周后,與空白對(duì)照組比較,養(yǎng)陰益氣膠囊小劑量組、大劑量組各臟器系數(shù)及生殖腺系數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表4。

表4 3組大鼠灌胃180 d和停藥2周后臟器系數(shù)和生殖腺系數(shù)比較

2.5組織病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組及大劑量組有個(gè)別動(dòng)物肝細(xì)胞有輕度水樣變性,2組間有輕度水樣變性的細(xì)胞,數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其他未見明顯病變,見圖1。

圖1 3組大鼠給藥180 d肝臟組織病理圖(HE,×100)

3 討論

藥物養(yǎng)陰益氣膠囊經(jīng)過長期灌胃給藥(6個(gè)月)后毒性情況研究結(jié)果顯示,安全性總體良好,部分異常數(shù)據(jù)主要集中在血生化指標(biāo),如大劑量組大鼠BUN水平高于空白對(duì)照組,但仍在正常范圍內(nèi),且大劑量相當(dāng)于臨床用藥劑量的60倍,小劑量組大鼠則未出現(xiàn)BUN增高的情況。此外,停藥2周后觀察,大劑量組大鼠BUN已恢復(fù)正常,表明大劑量藥物所致BUN異常在停藥后可逆,且臨床擬用量遠(yuǎn)小于該劑量,故綜合來看,大鼠灌胃養(yǎng)陰益氣膠囊6個(gè)月,生藥安全劑量20 g·kg-1,且該劑量相當(dāng)于臨床擬用量的60倍,整體安全性較好。

按照相關(guān)指導(dǎo)原則[13],中成藥因受制于制劑因素,在開展毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),尤其是急性毒性實(shí)驗(yàn)與長期毒性實(shí)驗(yàn)時(shí),一般會(huì)采用浸膏進(jìn)行給藥,目的是能給予足夠大劑量,以充分暴露產(chǎn)品毒性情況。因此,浸膏作為中成藥所有物質(zhì)成分的集合物,基本可以代替成品制劑進(jìn)行毒理學(xué)研究,且相對(duì)于成品制劑而言,更能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品的毒性作用。而與本文浸膏所混合的輔料均為國家認(rèn)可的無活性物質(zhì),并不會(huì)影響藥物安全性的評(píng)價(jià)。

當(dāng)然,本研究仍存在一定的不足,由于本品的有效成分及其檢測方法研究尚需改進(jìn),未能伴隨毒動(dòng)學(xué)研究,尚不能從物質(zhì)基礎(chǔ)角度探索本品的安全性情況,僅通過動(dòng)物行為表現(xiàn)、相關(guān)生理指標(biāo)來反映。為此,后續(xù)將進(jìn)一步通過腦卒中伴糖尿病動(dòng)物開展PK-PD模型研究,以更加全面、深入地探索本品療效與安全性。