黃艷,蔣佳洛,楊南楠,郭家富,張建,饒朝龍

(成都中醫(yī)藥大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院;2.公共衛(wèi)生學(xué)院藥食同用中藥效用與安全研究中心;3.藥學(xué)院,成都 611137)

近年來,國內(nèi)外有關(guān)藥食同源中藥引起肝損傷的報道大量增加,其中包括梔子、薄荷和肉桂等[1]。竹葉花椒是蕓香科花椒屬植物竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)(簡稱:ZADC)夏末秋初采收近成熟尚綠的成熟果實,與花椒屬于同一亞屬[2]。ZADC也是四川特色藥食同源資源,現(xiàn)代研究指出其具有抗氧化、抗菌和抗炎等藥理作用,因此常用于解熱、解毒、開胃、治療牙痛和消化不良[3-4]?！吨腥A本草》《四川常用中草藥》等記載ZADC有小毒,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)ZADC可抑制植物和動物的存活率[5]。有研究指出ZADC能引起大鼠肝細(xì)胞BRL 3A細(xì)胞周期阻滯以及DNA損傷[6]。但ZADC引起肝毒性的潛在作用機(jī)制尚未完全闡明。因此,闡明ZADC引起的肝毒性機(jī)制將促進(jìn)ZADC應(yīng)用的安全性,有助于完善ZADC毒性研究。在自噬過程中,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target rapamycin,mTOR)是自噬的重要調(diào)節(jié)分子,是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,活化的mTOR可抑制自噬[7]。Unc-51樣激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1)作為調(diào)控自噬的多重信號聚焦點,在營養(yǎng)不足情況下被激活的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)直接磷酸化ULK1Ser317和ULK1Ser777激活自噬,相反,mTOR磷酸化ULK1Ser757從而抑制自噬,破壞ULK1和AMPK之間的相互作用[8]。研究顯示,自噬紊亂可引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積、肝細(xì)胞凋亡以及肝細(xì)胞功能障礙[9]。另有研究顯示,自噬功能失調(diào)將引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過度累積,如自噬缺乏所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平上調(diào)可引起肝細(xì)胞損傷[10]。正常大鼠肝細(xì)胞BRL 3A細(xì)胞是大鼠肝臟間質(zhì)細(xì)胞,來源于大鼠的肝臟,其保留了肝細(xì)胞許多生物學(xué)特性。因此,本研究采用BRL 3A細(xì)胞,旨在探索竹葉花椒甲醇提取物引起肝細(xì)胞損傷的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材 竹葉花椒果實采摘于幺麻子食品有限公司四川眉山種植基地,由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高繼海副教授鑒定為竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的果實。

1.1.2細(xì)胞 BRL 3A細(xì)胞(Procell CL-0036)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供,在本實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.3主要實驗材料 BRL 3A細(xì)胞專用培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽,批號:CM-0036、PM150467),胎牛血清(美國Gibco,批號:26010074),0.25% 胰蛋白酶、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索萊寶,批號:P1260-1,D8371-250),Anti-beta Actin Rabbit pAb、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號GB11001、GB23303、GB22303),活性氧水平檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:E004-1-1),CCK-8試劑盒(Biosharp,批號:BS350B),RIPA裂解液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司,批號:P0013B),p-mTOR、mTOR、ULK1、Beclin-1、LC3B(Cell Signaling Technology,批號:5536S、2983S、8054S、3495S、43566S),p-ULK1(Affinity,批號:AB2844452),二甲雙胍、3-甲基腺嘌呤(3-MA)(MedChemExpress,批號:HY-B0627、HY-19312),其他所用試劑均為分析純。細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國美墨爾特),全波長酶標(biāo)儀(美國BioTek),Facsverse型流式細(xì)胞儀(美國BD公司),DYY-6D型電泳儀(北京六一科技有限公司),FV1200型激光共聚焦(奧林巴斯)。

1.2竹葉花椒甲醇提取物(ZADCM)的制備 參照文獻(xiàn)[6]提取方法。將竹葉花椒干果0.5 kg加入甲醇溶液2.5 L中,密封浸泡24 h,利用濾紙抽濾、40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),于40 ℃下烘干除盡甲醇后恒重收集浸膏,保存于-20 ℃供進(jìn)一步使用,總提取率約為10.5%。藥物處理時,將浸膏溶解在DMSO中,確保DMSO最大濃度<1‰。

1.3細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物處理 BRL 3A細(xì)胞系是來自大鼠肝組織的貼壁細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(10%)和青霉素-鏈霉素溶液(1%)的BRL 3A細(xì)胞特異性培養(yǎng)基中,在37 ℃,含5%二氧化碳(CO2)的環(huán)境中培養(yǎng)。將BRL 3A細(xì)胞與ZADCM(70 μg·mL-1)處理3、6、12、24 h或不同濃度的ZADCM(30、50、70 μg·mL-1)孵育24 h[7],同時給予或不給予3-MA(10 mmol·L-1)或二甲雙胍(2.5 mmol·L-1)預(yù)處理1 h。

1.4CCK-8法檢測BRL 3A細(xì)胞存活率 將密度為每孔6×103個的細(xì)胞接種于96孔板,用30、50和70 μg·mL-1ZADCM處理24 h[6]。同時,以1‰ DMSO為溶劑對照。加入CCK-8試劑(10 μL),孵育3 h后在450 nm波長下檢測吸光度(A值)。

1.5BRL 3A細(xì)胞內(nèi)ROS累積的檢測 采用DCFH-DA染色BRL 3A細(xì)胞,用激光共聚焦和流式細(xì)胞儀檢測ROS水平變化。將細(xì)胞密度為每皿15×104個細(xì)胞接種到規(guī)格為15 mm培養(yǎng)皿中,ZADCM處理24 h后,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saling,PBS)輕晃清洗細(xì)胞表面1～3次,避光孵育DCFH-DA探針30 min,再次利用PBS進(jìn)行清洗,去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的DCFH-DA探針,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,拍攝照片。將密度為每孔35×104個的細(xì)胞接種于6孔板中,用ZADCM處理后,用10 μmol·L-1DCFH-DA處理30 min。PBS洗滌3次后,胰酶消化收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.6免疫熒光檢測自噬標(biāo)志性蛋白表達(dá) 將細(xì)胞密度為每皿15×104個的細(xì)胞接種到規(guī)格為15 mm培養(yǎng)皿中,用ZADCM處理24 h后,4%甲醛固定30 min,PBS洗滌3次,用0.2% TritonX-100滲透。然后以5% BSA作為阻斷緩沖液,與一抗在4 ℃下孵育過夜。用PBS洗滌細(xì)胞1或2次,并與FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG在黑暗中孵育30 min。采用Hoechst 33342染料染細(xì)胞核15～20 min,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,攝像。

1.7Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液在低溫條件下從細(xì)胞中提取總蛋白,測定總蛋白濃度。同樣數(shù)量的蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠中電泳(濃縮膠濃度為10%,分離膠濃度為10%或12%),轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1～2 h后,在4 ℃冰箱中孵育一抗(稀釋比例均為1：1 000)過夜。用TBST洗滌3次,加入二抗(稀釋比例1：5 000),室溫孵育1 h。TBST洗滌3次后,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemilu-minescence,ECL)顯影液檢測蛋白水平,并歸一化至相應(yīng)的β-actin灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0版Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,GraphPad Prism 7.0版軟件作圖。多組均值比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnett檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ZADCM抑制BRL 3A細(xì)胞自噬 生理狀態(tài)下,基礎(chǔ)水平的自噬可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),而不足或過量的自噬可能破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)而促進(jìn)細(xì)胞死亡[11]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn),ZADCM可引起B(yǎng)RL 3A細(xì)胞存活率降低,因此,推測ZADCM誘導(dǎo)的BRL 3A細(xì)胞損傷可能與自噬有關(guān)。由于自噬是一個動態(tài)的變化過程,因此采用BRL 3A細(xì)胞在ZADCM(70 μg·mL-1)的處理下作用不同時間(3、6、12、24 h),結(jié)果顯示,ZADCM處理24 h后,抑制BRL 3A細(xì)胞中LC3B和Beclin-1蛋白的表達(dá)水平(圖1)。進(jìn)一步,免疫熒光技術(shù)測量了BRL 3A細(xì)胞中的自噬標(biāo)志性蛋白LC3B。結(jié)果顯示,與對照組比較,BRL 3A細(xì)胞中LC3B蛋白的熒光強(qiáng)度明顯降低并呈劑量依賴性(圖2)。

①與對照組比較,F=15.150,P<0.05;②與對照組比較,F=409.938,P<0.01。

①與對照組比較,F=37.482～62.258,P<0.05;②與對照組比較,F=11.024,5.731,P<0.01。

2.2ZADCM通過激活mTOR/ULK1信號通路抑制BRL 3A細(xì)胞自噬 為了探明ZADCM抑制細(xì)胞自噬活性的分子機(jī)制,本研究檢測了mTOR/ULK1信號通路。通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),在ZADCM處理BRL 3A細(xì)胞不同時間點后,ZADCM處理12和24 h后的mTORSer2448、ULK1Ser757的磷酸化水平升高(圖3),結(jié)果提示ZADCM誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制可能與激活mTOR/ULK1信號通路有關(guān)。

①與對照組比較,F=7.870～21.443,P<0.05。

2.3ZADCM誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞中ROS累積 氧化應(yīng)激引起的肝細(xì)胞損傷可能是中藥引起肝臟疾病的共同病理生理基礎(chǔ),因此本研究用不同濃度的ZADCM處理細(xì)胞24 h,對照組和30、50、70 mg·mL-1組的ROS熒光強(qiáng)度分別是(142.33±7.51),(163.67±3.37),(235.33±2.56),(370.33±2.71);與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.438,P<0.05;F=172.22,4 078.62,F=0.01)。

結(jié)果顯示,ZADCM誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生并呈劑量依賴性(圖4)。

圖4 ZADCM對BRL 3A細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.4二甲雙胍和3-MA對BRL 3A細(xì)胞自噬與ROS累積的影響 氧化應(yīng)激與自噬互相調(diào)控,因此,推測ZADCM誘導(dǎo)的BRL 3A細(xì)胞中ROS累積可能與自噬抑制有關(guān)。為驗證這一假設(shè),二甲雙胍預(yù)處理BRL 3A細(xì)胞1 h后,ZADCM誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin-1的抑制被逆轉(zhuǎn)(圖5)。采用3-MA預(yù)處理1 h后,LC3B和Beclin-1蛋白的抑制更加明顯。與ZADCM組比較,二甲雙胍組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量減少,細(xì)胞活力升高。而3-MA組的細(xì)胞內(nèi)ROS生成量增加,細(xì)胞活力降低(圖6)。以上結(jié)果顯示,ZADCM可能通過誘導(dǎo)自噬抑制引起ROS累積,從而引起B(yǎng)RL 3A細(xì)胞活力下降。

①與對照組比較,F=59.504～78.525,P<0.01;②與ZADCM組比較,F=15.480,P<0.01;③與ZADCM組比較,F=2.991～5.215,P<0.05;④與對照組比較,F=64.178,P<0.05。

①與對照組比較,F=391.712～1017.125,P<0.01;②與ZADCM組比較,F=5.167,4.684,P<0.05;③與ZADCM組比較,F=51.317,83.603,P<0.01。

3 討論

肝毒性是中藥引起嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)之一,近年有關(guān)中藥引起肝毒性的臨床病例和實驗研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)中藥未經(jīng)過上市前的毒性測試,已造成不同程度的肝損傷。例如,決明子和白果等中藥可通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑引起大鼠肝功能紊亂和肝細(xì)胞毒性[1]。因此,中藥的肝毒性值得探究。

竹葉花椒,味辛、微苦,有小毒,研究已報道ZADCM含有生物堿、脂肪酸和萜類化合物等[6]。研究發(fā)現(xiàn),吡咯里西啶類生物堿(PAs)可誘發(fā)肝竇阻塞綜合征,長期暴露于PAs,可引起肝纖維化和膽管上皮增生[12]。此外,過量的脂肪酸可抑制肝細(xì)胞活性并誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[13]。因此,ZADCM誘導(dǎo)的BRL 3A細(xì)胞損傷可能與ZADCM中的生物堿和脂肪酸類物質(zhì)有關(guān)。

肝細(xì)胞損傷是諸多肝病長期存在的共同病理表現(xiàn),自噬是肝細(xì)胞損傷中的一種主要機(jī)制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)ZADCM處理BRL 3A細(xì)胞后,細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白水平降低,免疫熒光結(jié)果顯示LC3B熒光強(qiáng)度也逐漸降低。這些結(jié)果均提示ZADCM的細(xì)胞毒性與其抑制BRL 3A細(xì)胞自噬密切相關(guān)。此外,自噬的調(diào)控機(jī)制涉及不同分子和信號通路,本研究發(fā)現(xiàn),ZADCM處理12或24 h后,mTORSer2448和ULK1Ser757的磷酸化水平顯著升高。這一結(jié)果提示ZADCM誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞自噬抑制可能與mTOR/ULK1信號通路的激活有關(guān)。

過量ROS的生成已成為肝損傷發(fā)生機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。因此,本研究通過流式細(xì)胞儀和激光共聚焦觀察ZADCM對肝細(xì)胞ROS水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZADCM可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS累積,這一結(jié)果與JIANG等[6]結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激與自噬相互調(diào)控,自噬可能通過吞噬和降解氧化物質(zhì)清除ROS,減少氧化損傷[14]?；谝陨辖Y(jié)果,對BRL 3A細(xì)胞抑制性自噬與ROS累積之間的聯(lián)系進(jìn)行探究。采用二甲雙胍或3-MA預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低或增加,細(xì)胞活力升高或降低。結(jié)果提示ZADCM誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞ROS累積可能與自噬抑制有關(guān)。

綜上所述,ZADCM可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬抑制從而誘導(dǎo)ROS累積,引起大鼠肝細(xì)胞損傷。雖然ZADCM誘導(dǎo)肝損傷的作用機(jī)制已有初步研究,但其仍是一種混合物,并且只對藥物作用細(xì)胞24 h后進(jìn)行了探究。因此,在進(jìn)一步的研究中,應(yīng)探索其誘導(dǎo)肝損傷的具體毒性物質(zhì)基礎(chǔ)以及其他藥物作用時間點進(jìn)行研究,為ZADC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的預(yù)防提供新的見解以及為ZADC的應(yīng)用提供基礎(chǔ)科學(xué)證據(jù)。