魏 晶，何雅琪，薛 田，柏乾明，水若鴻，陸洪芬，李小秋，于寶華

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

2017版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）淋巴造血組織腫瘤分類標準［1］首次提出伴MYC、BCL2和（或）BCL6重排的高級別B細胞淋巴瘤（high-grade B-cell lymphoma，HGBL），即雙重打擊淋巴瘤（double-hit lymphoma，DHL）和三重打擊淋巴瘤（triple-hit lymphoma，THL）的概念。2022年第5版WHO淋巴造血組織腫瘤分類標準［2］中不再強調(diào)BCL6基因重排，將伴有MYC與BCL2基因斷裂重排、無論是否有BCL6基因重排的HGBL均歸類為伴MYC和BCL2重排的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）/HGBL。既往研究［3-7］認為同時伴MYC、BCL2和BCL6重排的DLBCL/HGBL（即THL）具有侵襲性高、易復(fù)發(fā)及預(yù)后不良等特征。然而目前關(guān)于THL的文獻報道較少，且多為不足10例的小樣本及個案報道［8-16］，因此對于這種少見疾病仍缺乏充分認識。盡管新版WHO淋巴造血組織腫瘤分類標準中不再強調(diào)THL的概念，但實際仍存在爭議。因此增加對這組疾病臨床特點、病理學(xué)特征、免疫表型及預(yù)后等的深入了解，有望為其精準診斷、準確分類及優(yōu)化治療策略提供更充分的依 據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2016年6月—2021年12月診斷的THL病例10例。所有病例均由2名經(jīng)驗豐富的淋巴造血組織病理?？漆t(yī)師復(fù)閱切片。通過查閱電子病例及電話隨訪獲得臨床資料及預(yù)后信息。

銀行以理財?shù)荣Y金出資作為優(yōu)先級，由建設(shè)運營實施主體出資作為劣后級?；稹⒔ㄔO(shè)運營主體（或有）、政府或其出資代表方（或有）共同出資設(shè)立項目公司。由項目公司作為PPP項目實施主體，參與項目建設(shè)并收取運營收益。

第一，資金要向西部傾斜。中央財政做的最重要的一個事就是把發(fā)達地區(qū)的錢往中西部轉(zhuǎn)移，尤其是往西部地區(qū)轉(zhuǎn)移，這項工作我們繼續(xù)要做，加大一般性轉(zhuǎn)移支付和專項轉(zhuǎn)移支付力度，從根本上增加西部地區(qū)的財力，讓他們能夠統(tǒng)籌使用資金。水利的一些專項資金，尤其是一些因素法分配的資金，包括這次已經(jīng)報國務(wù)院批的中央統(tǒng)籌部分從土地出讓收益計提的農(nóng)田水利資金，里面也專門有一條，就是向西部老少邊窮地區(qū)傾斜。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測

所有標本均經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3～4 μm連續(xù)切片，H-E染色觀察其組織病理學(xué)形態(tài)，使用Ventana Benchmark XT全自動免疫組織化學(xué)分析儀（美國Roche Ventana公司）進行EnVision二步法免疫組織化學(xué)染色。一抗包括CD20、BCL2、CD5、CD30、Ki-67、cyclin D1（以上均購自美國Roche公司）、CD10（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、BCL6（德國Leica公司）、MYC（英國Abcam公司）、MUM1及P53（丹麥Dako公司）等。依據(jù)Hans分型法則［14］進行細胞起源分型。依據(jù)WHO分類［1］中的定義，將腫瘤細胞MYC蛋白表達≥40%且BCL2蛋白表達≥50%定義為雙表達。

1.3 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測

采用FISH分別檢測MYC、BCL2及BCL6基因斷裂重排，所有病例均有＞50%的腫瘤細胞內(nèi)可見紅、綠分離信號，即均有MYC、BCL2和BCL6基因相關(guān)易位（圖3A ～ 3C）。其中1例患者（病例1）同時顯示部分腫瘤細胞內(nèi)MYC基因拷貝數(shù)增加，提示基因擴增（圖3D）。

1.4 EB病毒編碼RNA（Epstein-Barr virusencoded RNA，EBER）原位雜交檢測

本組患者截至隨訪結(jié)束7例存活，3例死亡。患者總生存期（overall survival，OS）為2.0 ～ 55.5個月，中位OS為16.8個月，1年OS率為68.6%。6例Ⅰ/Ⅱ期患者均存活，而4例Ⅲ/Ⅳ期患者僅1例存活，1年OS率分別為100%和25%。4例伴骨髓侵犯的患者中僅1例存活，1年OS率為25%；4例未累及骨髓的患者均存活，1年OS率為100%。4例有既往HBV感染史的患者中2例存活，1年OS率為50%；6例無HBV感染史的患者中5例存活，1年OS率為83.3%。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

大帥因為聽了大帥一句“這個女人我認識”，下意識的看了大帥的臉，錯過了定睛的機會，但是左小龍還有機會，因為大帥的摩托車要比這姑娘的踏板車快一些，況且左小龍得以聽了這么多句，說明姑娘開的真的很慢，這樣一方面得以巡展，一方面也可以保持芳容。左小龍開著大帥的摩托車跟隨了上去，左小龍鎮(zhèn)定的超過的小踏板，看了一眼。姑娘很享受這一眼。左小龍通過這一眼也想起了她是誰，早在兩年前的大禮堂，左小龍就很喜歡她，她就是黃瑩。

表1 10例THL的臨床特征Tab. 1 Clinical features of 10 cases with THL

2.2 病理學(xué)形態(tài)特征

免疫組織化學(xué)染色及EBER原位雜交結(jié)果見表2，10例患者均彌漫表達成熟B細胞標志物CD20（圖2B）。CD10、BCL6和MUM1陽性率分別為70%（7/10）、80%（8/10）和10%（1/10）（圖2C ～ 2E）。根據(jù)Hans分型法則，8例（80%）患者為生發(fā)中心B細胞（germinal center B-cell，GCB）型，2例（20%）為非GCB（non-GCB）型。MYC蛋白陽性率為89%（8/9），其中3例為40% ～ 70%，5例≥70%（圖2F）。BCL2陽性率為90%（9/10，圖2G）。78%（7/9）的患者呈MYC/BCL2雙表達，BCL6陽性率為80%，Ki-67增殖指數(shù)均較高（≥80%，圖2H）。EBER原位雜交結(jié)果均陰性（0/6）。

THL較罕見，僅占DLBCL的0.4%［15］。目前國內(nèi)外相關(guān)研究報道［8-11］較少，對該疾病的臨床病理學(xué)特征及患者預(yù)后尚缺乏充分認識。盡管2022年新版WHO分類［2］不再強調(diào)BCL6基因斷裂重排，并且不再強調(diào)THL這一概念，但實際上仍存在爭議。因此，增加對這組特殊病例臨床病理學(xué)特征的認識，對于準確診斷、合理分類、優(yōu)化治療策略及預(yù)后預(yù)測都具有重要意義。

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2016年6月—2021年12月行MYC、BCL2、BCL6基因易位檢測的侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）共924例，其中10例為THL，僅占1.1%。10例THL患者中，男性4例，女性6例。中位年齡54歲（43～80歲）。其中2例發(fā)生于淋巴結(jié)，6例發(fā)生于淋巴結(jié)外器官（2例發(fā)生于雙側(cè)睪丸，3例發(fā)生于胃腸道，1例表現(xiàn)為多發(fā)骨病變），其余2例表現(xiàn)為結(jié)內(nèi)和結(jié)外多部位受累。6例患者臨床分期為Ⅰ/Ⅱ期（60%），4例為Ⅲ/Ⅳ期（40%）。10例患者中2例（20%）有B癥狀（發(fā)熱和體重下降各1例）。50%（3/6）患者乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平高于正常值。國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分中高危及高危（≥3分）占40%（4/10），低危及低中危（0 ～ 2分）占60%（6/10）。50%（4/8）的患者有骨髓侵犯。8例進行過乙肝5項檢測：即乙肝病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（hepatitis B virus surface antibody，HBsAb）、乙肝病毒e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）、乙肝病毒e抗體（hepatitis B virus e antibody，HBeAb）和乙肝病毒核心抗體（hepatitis B virus core antibody，HBcAb）。8例患者HBsAg和HBeAg均陰性，其中2例HBsAb、HBeAb、HBcAb三項抗體均陽性，各有1例分別HBcAb、HBeAb、HBsAb陽性，3例乙肝5項均陰性；其中6例進行過乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA檢測者均陰性。其余2例否認有乙型肝炎病史但未獲得相關(guān)檢測信息。具體臨床特征見表1。

圖1 THL的組織學(xué)形態(tài)Fig.1 Histological features of THL

圖2 1例發(fā)生于睪丸的THL（病例4）組織學(xué)形態(tài)及免疫表型，免疫組織化學(xué)染色顯示為GCB型且伴MYC/BCL2雙表達Fig. 2 A representative case of THL occurred in testis (case 4), immunohistochemical staining indicated GCB subtype with MYC/BCL2 double expression

2.3 免疫表型及原位雜交結(jié)果

顯微鏡下觀察患者的組織學(xué)形態(tài)，除2例因組織擠壓嚴重?zé)o法進行準確的組織學(xué)分類外，5例（62.5%）患者呈非特指DLBCL（DLBCL,not otherwise specified，DLBCL-NOS）形態(tài)（圖1A，圖2A）：腫瘤細胞核中等偏大，卵圓形或不規(guī)則，部分呈空泡狀，核仁明顯；細胞質(zhì)中等量呈弱嗜堿性，間質(zhì)中可見纖細的纖維膠原穿插分隔，其中1例伴有星空現(xiàn)象。2例（25%）患者腫瘤細胞形態(tài)兼具DLBCL和伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的特征（圖1B）：腫瘤細胞中等大小，細胞核圓形或卵圓形且染色質(zhì)細，少量嗜堿性細胞質(zhì)，核分裂象多見，細胞凋亡及壞死明顯，并可見星空現(xiàn)象；背景中小淋巴細胞少見。1例（12.5%）為淋巴母細胞樣形態(tài)（圖1C）：腫瘤細胞形態(tài)較單一，細胞核中等大小，染色質(zhì)呈細顆粒狀，核仁不明顯，細胞質(zhì)稀少；細胞排列密集，間質(zhì)成分稀少，星空現(xiàn)象不明顯。

表2 10例THL免疫組織化學(xué)染色及EBER原位雜交結(jié)果Tab. 2 Immunohistochemical stain and EBER-in situ hybridization results of 10 cases with THL

2.4 FISH檢測結(jié)果

應(yīng)用MYC、BCL2、BCL6雙色熒光分離探針試劑盒（購自美國Abbott公司）進行FISH檢測，具體操作程序參照說明書進行。在熒光顯微鏡下計數(shù)至少100個有紅、綠雙色信號的細胞核。若腫瘤細胞內(nèi)出現(xiàn)紅、綠分離信號或單獨紅色、綠色信號時視為陽性細胞。當(dāng)陽性細胞數(shù)占比≥15%時診斷為有該基因相關(guān)易位。腫瘤細胞顯示3個及以上紅、綠信號或紅、綠融合的黃色信號時提示基因擴增。

圖3 FISH檢測顯示MYC、BCL2和BCL6基因異常Fig. 3 FISH test showed alterations of MYC, BCL2 and BCL6 genes

2.5 治療和預(yù)后

本組患者中4例行腫瘤切除術(shù)，其余6例均通過活檢獲得診斷。除1例手術(shù)切除病灶后因身體狀況差僅行支持治療外，其余9例均接受系統(tǒng)治療。4例采用DA-EPOCH-R方案，其中1例完全緩解（complete response，CR）后接受自體造血干細胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT）；2例采用R-CHOP方案；1例采用DA-TEDII-R方案6個療程后患者一般狀況不佳回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院接受放療；其余2例具體化療方案不詳。

每畦鋪設(shè)Φ16 mm滴管5條；鋪設(shè)2絲(0.2 mm)厚、12×12 cm網(wǎng)洞規(guī)格地膜1層，起到減少雜草生長、保濕、保護小苗根系作用。

EBER探針購自德國Leica公司。按照試劑盒說明書進行EBER原位雜交檢測。采用3,3-二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）顯色方法，陽性信號著色為棕褐色。

3 討 論

3)新方案可采用凝結(jié)水或工業(yè)冷卻水作為冷源，利用除塵器前或脫硫塔前的高溫?zé)煔庾鳛闊嵩?。富余的高溫?zé)煔庥酂峥梢杂糜诩訜崂滹L(fēng)或凝結(jié)水，飽和煙氣余熱可用于加熱凝結(jié)水，增加排擠汽機抽汽所做的熱功，提高機組效率，獲得更好的節(jié)能效益。

THL好發(fā)于中老年人，本研究患者的中位年齡（54歲）與既往報道（51～64歲）［13，16-17］相似。Huang等［16］報道40例THL患者中男性多于女性（5∶3），本研究并未顯示出男女差異。THL好發(fā)于淋巴結(jié)外器官，如胃腸道、睪丸等，且易發(fā)生骨髓侵犯。THL侵犯罕見部位也有個別報道，如海綿竇、心包等［18-19］。值得注意的是，與既往文獻中THL/DHL以Ⅲ/Ⅳ期為主（80% ～ 90%）［6，9，16］不同，本研究患者中一半以上為Ⅰ/Ⅱ期，而Ⅲ/Ⅳ期占比較低（40%）；高IPI評分患者的比例（40%≥3分）也低于既往報道（80%≥3分）?？赡苁怯捎诒狙芯炕颊邤?shù)較少，有待于積累更多病例以增加對其臨床特征的充分認識。

有研究［20-22］表明，HBV感染與NHL密切相關(guān)，無論處于慢性HBV感染期還是既往感染過HBV的患者發(fā)生NHL的風(fēng)險均有所增加，伴HBV感染的NHL患者比未感染過HBV的患者發(fā)病年齡更年輕且預(yù)后更差。Ren等［23］研究顯示，與HBsAg陰性DLBCL（28%）相比，HBsAg陽性DLBCL（57%）患者呈現(xiàn)出更高頻的BCL6基因易位重排。Zhang等［17］研究顯示，THL/DHL患者中約53.2%伴既往HBV感染（其中包含3例THL患者且均有HBV感染），這部分患者的OS顯著差于無HBV感染者，并且HBsAg+與MYC/BCL6-DHL及THL的發(fā)生有關(guān)。因此針對HBV感染的免疫調(diào)節(jié)方案可能會提高這部分患者常規(guī)放化療和HSCT的治療效果［24］。本研究中40%患者有HBV既往感染史，且其1年OS率較無HBV感染者低。但由于目前病例數(shù)有限，尚需積累更多病例進一步驗證，并深入研究其機制，以探討針對這部分患者的有效治療策略。

THL/DHL的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多樣，其中超過半數(shù)呈現(xiàn)出DLBCL-NOS的形態(tài)特征，介于DLBCL和BL之間者次之，母細胞樣形態(tài)者較少［1，9］。免疫表型方面，64%～100%的THL為GCB型［25-27］。THL/DHL往往伴有MYC/BCL2蛋白雙表達（70%～90%），且其陽性率顯著高于DLBCL-NOS［13，17，27］。BCL6蛋白在THL/DHL中也具有較高的表達率（75%～90%），Ki-67增殖指數(shù)通常較高（＞80%）［1］。因此有學(xué)者建議用上述蛋白表達作為THL的初篩手段，但由于THL缺乏特征性病理學(xué)形態(tài)特點并且免疫表型也缺乏特異性，因此依據(jù)組織學(xué)形態(tài)與免疫表型篩選THL并不準確且存在爭議?；诖?，WHO分類建議對所有DLBCL通過FISH檢測以明確是否存在MYC、BCL2和BCL6基因重排［1］。但FISH檢測費用昂貴，且在資源貧乏地區(qū)無法實現(xiàn)常規(guī)檢測，因此是否針對所有DLBCL患者進行上述3個基因斷裂重排的FISH檢測目前并未達成共識。有學(xué)者建議對免疫表型GCB型且MYC/BCL2蛋白高表達的DLBCL/HGBL首先進行MYC基因重排檢測，陽性者再進行BCL2和BCL6基因重排檢測［26-28］。近年來Ziepert等［29］提出將MYC蛋白表達的臨界值提高到70%，以此篩選出的MYC蛋白陽性病例中有44%通過FISH檢測存在MYC基因重排，而MYC蛋白表達40%～70%的病例中僅11%存在MYC基因重排，提示70%作為MYC陽性的臨界值可以更好地提示MYC基因重排。本研究患者中MYC蛋白表達≥70%者（56%）多于40% ～ 70%者（33%），同樣提示MYC蛋白表達≥70%與MYC重排具有更高的匹配度。

THL的一線治療策略目前尚缺乏共識。由于THL存在MYC基因重排，因此對R-CHOP方案的敏感性欠佳［30-32］。Oki等［6］研究顯示，接受強化誘導(dǎo)方案（DA-EPOCH-R、R-Hyper-CAVD）的DHL患者預(yù)后優(yōu)于傳統(tǒng)R-CHOP方案治療者。另外一項回顧性研究［4］顯示，THL/DHL患者接受強化誘導(dǎo)方案可以顯著地延長中位無進展生存時間（progression-free survival，PFS）（21.6個月vs7.8個月），但不能改善患者的OS。本研究一線采用DA-EPOCH-R方案的4例患者中3例獲得CR，1例部分緩解（partial response，PR）且在診斷10個月后死亡；采用R-CHOP方案的2例患者均獲得CR。但由于病例數(shù)少且臨床分期不同，尚不足以對不同治療策略的療效進行統(tǒng)計學(xué)分析。Auto-HSCT是治療復(fù)發(fā)難治性NHL的有效手段［19，33］，但是否可以改善THL患者的療效和生存目前相關(guān)研究有限。有研究［34］顯示，強化誘導(dǎo)方案化療后采用BEAC（卡莫司汀、依托泊苷、阿糖胞苷和環(huán)磷酰胺）預(yù)處理方案聯(lián)合組蛋白去乙?；敢种苿┪鬟_本胺和大劑量利妥昔單抗，然后再進行auto-HSCT治療，可以提高療效及耐受性；但該研究納入的病例數(shù)有限，因此仍需積累更多病例來進一步驗證。綜上所述，THL目前尚無規(guī)范化治療策略，尤其復(fù)發(fā)難治性THL的治療仍存在很大挑戰(zhàn)，需要更多前瞻性臨床試驗進行探索。

目前普遍認為，THL患者預(yù)后較差，總體與DHL相似，中位OS較DLBCL-NOS差［10，31，35］，但文獻報道中的THL生存時間存在較大差異。Tomita等［10］報道的THL患者中位OS為4 ～ 6個月，而Huang等［16］報道的40例THL患者中位OS為18個月，1年OS率為61%。本研究結(jié)果與Huang等報道的結(jié)果相似。有學(xué)者［3，20］認為，臨床分期晚、LDH水平在正常值3倍以上、伴骨髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯者預(yù)后更差。本研究截至隨訪結(jié)束時Ⅰ/Ⅱ期患者均獲得CR，1年OS率為100%，而Ⅲ/Ⅳ期患者的1年OS率僅為25%；盡管本組病例因數(shù)量有限尚不足以進行統(tǒng)計學(xué)分析，但目前結(jié)果提示早期準確診斷、及時干預(yù)對于改善THL患者的預(yù)后有重要意義，但尚需積累更大樣本量并延長隨訪時間以進一步分析其生存及預(yù)后。有研究［36］顯示，MYC拷貝數(shù)增加的THL/DHL患者（其中THL為3例）PFS和OS更差，但也有研究［37］顯示，MYC拷貝數(shù)增加（其中THL為3例）與預(yù)后無關(guān)。本研究中1例MYC拷貝數(shù)增加的患者預(yù)后也較差。另外有研究認為，MYC重排伙伴基因為免疫球蛋白（Immunoglobulin，IG）基因的患者預(yù)后更差［29］，而非IG者預(yù)后較好［38］。但也有研究［25］顯示，MYC易位伙伴基因是否為IG對DHL/THL預(yù)后并無影響。鑒于THL病例數(shù)少且研究結(jié)論各異，因此需要更大樣本量的研究以進一步探討MYC基因拷貝數(shù)增加及與不同伙伴基因易位重排的臨床病理學(xué)相關(guān)性及預(yù)后預(yù)測價值。

綜上所述，THL好發(fā)于中老年人，以結(jié)外器官受累更常見，是一組形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多樣、以GCB亞型為主且常伴有MYC/BCL2雙表達的侵襲性B細胞淋巴瘤。臨床Ⅲ/Ⅳ期者臨床進展迅速、易侵犯骨髓且預(yù)后較差；臨床分期Ⅰ/Ⅱ期者并不少見，系統(tǒng)治療后可以獲得較好的預(yù)后。由于THL發(fā)病率/檢出率較低，目前認識仍有限，因此仍需積累更多病例以進一步認識其臨床生物學(xué)特征，對于早期診斷、及早干預(yù)具有重要的臨床意義。深入探討其分子遺傳學(xué)特征及與DHL的相關(guān)性，有助于優(yōu)化分類分型，為合理治療、預(yù)后預(yù)測奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。