張志宇，白靜，白雪峰，孫金霞，陳盛清，孔祥虎

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014040 包頭市腫瘤醫(yī)院2放射治療科，3病理科，內(nèi)蒙古 包頭 014030

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2021 年全球乳腺癌新發(fā)病例230.9 萬例，成為全球最常見的惡性腫瘤，死亡例數(shù)居全球女性惡性腫瘤首位[1]。放療作為乳腺癌術(shù)后輔助治療的重要手段，可以顯著降低乳腺癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險[2]。放射抵抗是影響乳腺癌術(shù)后輔助放療療效的主要原因之一[3]。降低放射抵抗性，增加放療敏感性，對于降低乳腺癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)率、提高患者生存率具有重要意義。因此，尋找可預(yù)測放療敏感性的新指標(biāo)，既有助于找到放療增敏靶點，為放療增敏藥物的研發(fā)尋找最可能的獲益人群，又可指導(dǎo)臨床醫(yī)師制訂合理的個體化放療方案，提高不同亞型乳腺癌的放療效果。叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的發(fā)育和免疫抑制功能起到至關(guān)重要的作用，其在不同類型腫瘤細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)，可影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等，在乳腺癌中是重要的腫瘤抑制基因[4]，但其與放療療效的關(guān)系鮮有報道。本研究分析FOXP3 在乳腺癌放療患者中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2018 年12 月包頭市腫瘤醫(yī)院收治的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查首次確診為浸潤性乳腺癌；②行改良根治術(shù)、調(diào)強(qiáng)放射治療和術(shù)后輔助化療；③均為女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療及靶向治療；②合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；③臨床資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90例乳腺癌患者。另選取于包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的30 例乳腺纖維腺病患者。乳腺癌患者和乳腺纖維腺病患者的年齡分別為（42.5±6.9）歲和（44.3±8.2）歲，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化染色法檢測FOXP3 表達(dá)

將石蠟包埋的乳腺癌組織和乳腺纖維腺病組織標(biāo)本進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，然后二甲苯脫蠟，95%、75%梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次。高壓修復(fù)抗原，PBS沖洗3次，應(yīng)用免疫組化筆固定邊緣，雙氧水封閉，加入稀釋的兔抗人單克隆抗體FOXP3（1∶100），放在濕盒內(nèi)，4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗3 次，滴加酶標(biāo)記的二抗試劑后，將濕盒置于室溫孵育，PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

FOXP3 主要定位于細(xì)胞核，隨機(jī)選取5 個高倍視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞。由病理科2 位副主任醫(yī)師依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，意見不統(tǒng)一時共同商討決定最終結(jié)果。染色強(qiáng)度評分：無色計0 分，淡黃色計1 分，黃色計2分，棕黃色計3 分；陽性細(xì)胞所占比例評分：≤5%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，﹥50%計3分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞所占比例評分相乘，≥4 分為陽性，﹤4 分為陰性。

1.4 療效評價

將改良根治術(shù)和輔助放療后的局部失敗視為對放療反應(yīng)不佳（放療敏感性差）。放療結(jié)束3 個月后，胸壁、鎖骨、腋窩淋巴結(jié)引流區(qū)腫瘤復(fù)發(fā)或部分腫瘤組織仍殘留，定義為局部失敗，再結(jié)合影像學(xué)和病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行局部失敗的診斷[5]。局部失敗率=局部失敗例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 隨訪方法

所有患者均進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括體格檢查、影像學(xué)檢查、實驗室檢查，隨訪截止時間為2022 年2 月。前2 年每3 個月隨訪1 次，第3 年每半年隨訪1 次，之后每年隨訪1 次。無病生存期（disease-free survival，DFS）定義為手術(shù)開始至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，或由于任何原因?qū)е禄颊咚劳龅臅r間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Logistic 回歸模型分析乳腺癌患者中FOXP3陽性表達(dá)的影響因素，結(jié)果用校正后的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）和與之相應(yīng)的95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；采用Cox比例風(fēng)險模型分析乳腺癌放療患者DFS的影響因素。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和乳腺纖維腺病組織中FOXP3 表達(dá)情況的比較

乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)率為38.9%（35/90），明顯低于乳腺纖維腺病組織的76.7%（23/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.859，P=0.001）。（圖1）

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 表達(dá)情況的比較

不同臨床分期、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達(dá)情況、Ki-67表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。不同腫瘤最大徑、年齡、絕經(jīng)情況、生育次數(shù)、雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)情況、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)情況、p53 表達(dá)情況、組織學(xué)分級、脈管侵犯情況和神經(jīng)侵犯情況乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 表達(dá)情況的比較

2.3 乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)影響因素的多因素Logistic 回歸分析

以2.2 中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素作為自變量，乳腺癌患者中FOXP3陽性表達(dá)為因變量進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，臨床分期、Ki-67表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是乳腺癌患者中FOXP3陽性表達(dá)的獨立影響因素（P﹤0.05）。（表2）

表2 乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)影響因素的多因素Logistic 回歸分析

2.4 不同分子分型乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 表達(dá)情況的比較

Luminal A 型乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)率高于Luminal B 型、三陰性、HER2 過表達(dá)型乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。Luminal B 型、三陰性、HER2 過表達(dá)型乳腺癌患者FOXP3 陽性表達(dá)率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表3）

表3 不同分子分型乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.5 不同F(xiàn)OXP3 表達(dá)情況乳腺癌患者放療療效的比較

FOXP3 陽性表達(dá)乳腺癌患者的局部失敗率為2.9%（1/35），明顯低于FOXP3陰性表達(dá)患者的25.5%（14/55），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.864，P=0.005）。

2.6 不同F(xiàn)OXP3表達(dá)情況乳腺癌放療患者DFS的比較

90 例乳腺癌患者的隨訪時間為5～68 個月，中位隨訪時間為47 個月，在隨訪期內(nèi)，15 例患者復(fù)發(fā)，中位DFS 為60.31 個月，1 年無病生存率為95.6%，3 年無病生存率為88.2%，5 年無病生存率為72.3%。FOXP3 陽性表達(dá)乳腺癌患者的1、3、5年無病生存率分別為100%、100%、95.7%，F(xiàn)OXP3陰性表達(dá)乳腺癌患者的1、3、5 年無病生存率分別為94.5%、81.4%、38.6%，F(xiàn)OXP3 陽性表達(dá)乳腺癌患者的DFS 明顯優(yōu)于FOXP3 陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.753，P=0.002）（圖2）。

圖2 FOXP3陽性表達(dá)（n=35）和FOXP3陰性表達(dá)（n=55）乳腺癌放療患者的DFS曲線

2.7 乳腺癌放療患者DFS 影響因素的單因素和多因素分析

單因素分析顯示，乳腺癌放療患者的DFS 可能與腫瘤最大徑、臨床分期、年齡、絕經(jīng)情況、PR 表達(dá)情況、Ki-67 表達(dá)情況、組織學(xué)分級、脈管侵犯情況、神經(jīng)侵犯情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)（P﹥0.05），可能與分子分型、ER 表達(dá)情況、HER2 表達(dá)情況、FOXP3 表達(dá)情況有關(guān)（P﹤0.05）。以單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素作為自變量，乳腺癌放療患者的DFS 作為因變量進(jìn)行Cox 比例風(fēng)險回歸分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3 陽性表達(dá)、ER 陽性表達(dá)均是乳腺癌放療患者DFS 的獨立保護(hù)因素（P﹤0.05）。（表4、表5）

表4 乳腺癌放療患者DFS 影響因素的單因素分析

表5 乳腺癌放療患者DFS 影響因素的Cox 多因素回歸分析

3 討論

放療是乳腺癌的重要治療手段，可以明顯提高患者術(shù)后局部控制率，但也存在一些因素影響放療療效和預(yù)后[6]。通過檢測某些標(biāo)志物可以預(yù)測乳腺癌放療敏感性和放療療效。乳腺癌精準(zhǔn)放療的實施與患者的分子分型、基因組型及放療敏感性密切相關(guān)，個體化精準(zhǔn)放療可通過聯(lián)合靶向藥物、放射增敏劑或改進(jìn)放療技術(shù)，提高放療療效，減少乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高局部控制率，延長DFS。因此通過檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)預(yù)測放療敏感性，并以此為依據(jù)對乳腺癌患者制訂個體化放療方案，提高乳腺癌患者的放療療效是臨床研究的熱點。

McInnes 等[7]在BT549 乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 可以通過直接與SATB 同源框蛋白1（SATB homeobox 1，SATB1）基因啟動子結(jié)合抑制SATB1基因表達(dá)或是通過促進(jìn)微小RNA（microRNA，miRNA）-7 及miRNA-155 的表達(dá)沉默該基因，從而發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)率為38.9%，明顯低于乳腺纖維腺病組織的76.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01），說明FOXP3 具有抑癌作用，能夠抑制乳腺癌的發(fā)生。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期、Ki-67 表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)的獨立影響因素（P﹤0.05），臨床分期越低、Ki-67 表達(dá)水平越低，乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)率就越高，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。Lee 等[8]研究了不同分子分型乳腺癌對電離輻射的敏感性，結(jié)果表明，Luminal A 型乳腺癌細(xì)胞株的放射敏感性最強(qiáng)，HER2 過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞株具有輻射抵抗性，三陰性乳腺癌細(xì)胞株最耐輻射。本研究發(fā)現(xiàn)，Luminal A 型乳腺癌患者乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)率高于Luminal B 型、三陰性、HER2 過表達(dá)型乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），表明Luminal A 型乳腺癌患者中FOXP3 陽性表達(dá)率較高。Li 等[9]研究表明，F(xiàn)OXP3可以通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)抑制腫瘤新生血管生成。Lai 等[10]研究表明，VEGF 低表達(dá)可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）激活，其是通過抑制VEGF/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）/胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）/AKT 信號通路來實現(xiàn)的，一方面可以抑制乳腺癌新生血管生成和淋巴管再生，另外一方面可以通過觸發(fā)活性氧介導(dǎo)的DNA損傷增強(qiáng)凋亡效應(yīng)，從而增加放療敏感性。因此推測FOXP3 可通過下調(diào)VEGF/AKT 信號通路實現(xiàn)對放療敏感性的影響。本研究中FOXP3 陽性表達(dá)乳腺癌患者的局部失敗率為2.9%，明顯低于FOXP3 陰性表達(dá)患者的25.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01），也說明了FOXP3 陽性表達(dá)乳腺癌患者較FOXP3陰性表達(dá)患者的放療敏感性好。Lin等[11]對16 項臨床試驗共13 217 例乳腺癌患者進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3 表達(dá)對乳腺癌患者預(yù)后的影響與其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)部位、陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)、激素受體狀態(tài)及地域差異相關(guān)，可能受不同遺傳背景、手術(shù)方式及化療方案等因素影響，其中ER陽性、亞洲地區(qū)、以中位數(shù)作為陽性表達(dá)的cut-off值這3 種情況下，F(xiàn)OXP3 表達(dá)與DFS 及總生存期獲益顯著相關(guān)。本研究中，F(xiàn)OXP3 陽性表達(dá)患者的1、3、5 年無病生存率分別為100%、100%、95.7%，F(xiàn)OXP3 陰性表達(dá)患者的1、3、5 年無病生存率分別為94.5%、81.4%、38.6%，F(xiàn)OXP3 陽性表達(dá)患者的DFS 明顯優(yōu)于FOXP3 陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）；單因素及多因素分析顯示，F(xiàn)OXP3 陽性表達(dá)是乳腺癌放療患者DFS 的獨立保護(hù)因素（P﹤0.05）。提示干預(yù)FOXP3 蛋白表達(dá)或相關(guān)信號通路，有可能改善乳腺癌放療患者的預(yù)后，F(xiàn)OXP3 可作為乳腺癌的治療靶點。

綜上所述，乳腺癌組織中FOXP3陽性表達(dá)率較低，F(xiàn)OXP3陽性表達(dá)乳腺癌患者放療局部失敗率低于FOXP3 陰性表達(dá)患者，且預(yù)后優(yōu)于FOXP3 陰性表達(dá)患者，提高FOXP3表達(dá)水平能夠改善乳腺癌患者放療療效及預(yù)后。后續(xù)可通過基因敲除等技術(shù)進(jìn)一步驗證FOXP3與放療療效的關(guān)系，也可以選擇具有放療抵抗的乳腺癌患者開展前瞻性隨機(jī)對照、多臂多中心研究，觀察針對FOXP3靶點的放療增敏劑是否具有臨床療效。相信隨著FOXP3 的全面深入研究，F(xiàn)OXP3不僅會成為乳腺癌放療敏感性的分子標(biāo)志物及治療靶點，還有望為乳腺癌的診斷、個體化治療及預(yù)后評估提供新思路。