穆泓宇，何丹丹，王雅梅

首都醫(yī)科大學1中醫(yī)藥學院2019級五年制中醫(yī)專業(yè)，2基礎(chǔ)醫(yī)學院生化與分子生物學系，北京 100069

表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）敏感突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的一線用藥，可以通過競爭性結(jié)合EGFR 的ATP 位點來阻斷EGFR 末端磷酸化，阻止腫瘤細胞惡性增殖[1]。但絕大多數(shù)患者在治療6～12 個月后會不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥，使得疾病再次進展[2]。中藥既可以延緩EGFR-TKI 耐藥的發(fā)生，又可以在耐藥后增強EGFR-TKI 的抗腫瘤效果，起到協(xié)同增效的作用，是NSCLC 綜合治療的重要手段。近年來，相關(guān)綜述大多集中在臨床療效的觀察與中醫(yī)理論的探討，少有針對中藥作用機制的系統(tǒng)總結(jié)?；诖?，本文對中藥延緩NSCLC EGFR-TKI 耐藥機制的研究進展進行綜述，以期為NSCLC 的中西醫(yī)結(jié)合治療提供作用機制方面的參考。

1 抑制EGFR 下游通路異常激活

EGFR 下游信號通路的持續(xù)活化是EGFR-TKI耐藥的原因之一。當EGFR 被酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）抑制后，其他受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）可形成異源二聚體，代償性地激活下游信號通路，使得作用于單一靶點的EGFR-TKI 失效。中藥可以作用于EGFR 的下游通路，抑制其異常激活，進而延緩耐藥。目前研究較為清楚的主要途徑有以下3 條。

1.1 抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路

PI3K 是細胞外信號與細胞內(nèi)應(yīng)答的中轉(zhuǎn)站，可以刺激細胞產(chǎn)生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate，PIP3），并誘導下游AKT活化，從而啟動凋亡、自噬相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT 及其下游通路的激活，可抑制腫瘤細胞耐藥。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以有效抑制PI3K/AKT 通路，并延緩EGFR-TKI 耐藥的出現(xiàn)。中藥單體葫蘆素E 和楊梅黃酮的組合物可以抑制NSCLC PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路介導的細胞自噬與活化[3]。重樓的單體成分重樓皂苷Ⅵ可以抑制PI3K/AKT 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）對MTOR 的正向調(diào)節(jié)，同時激活AMP 依賴的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）對MTOR 的負向調(diào)節(jié)，通過多種途徑誘導NSCLC 細胞凋亡和自噬[4]。上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院徐振曄教授研制的肺巖寧方[5]、浙江省中醫(yī)院舒琦瑾教授研制的養(yǎng)陰解毒湯[6]以及臨床常用中成藥復方苦參注射液[7]均可顯著下調(diào)H1975 耐藥細胞中p-PI3K、p-AKT 的水平，通過阻止PI3K/AKT 活化促進細胞凋亡，抑制耐藥細胞體外增殖。藤黃的活性成分藤黃酸在與?？颂婺崧?lián)合應(yīng)用時也被觀察到了同樣的磷酸化抑制效應(yīng)[8]。

此外，另有研究發(fā)現(xiàn)第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）作為負向調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的主要蛋白，與EGFR-TKI 耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。金復康口服液與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高接種過PC9/R 耐藥細胞的裸鼠移植瘤的生長抑制率，推測其機制可能與下調(diào)腫瘤組織中p-AKT 水平，上調(diào)PTEN、PDCD4等抑癌基因的表達有關(guān)[10]。進一步檢測其上游微小RNA（microRNA，miRNA）發(fā)現(xiàn)，金復康口服液增強PTEN 的效應(yīng)極有可能是通過降低miRNA-21 的表達而實現(xiàn)的[11]。上述實驗結(jié)果表明EGFR 下游的PI3K/AKT 信號通路是中藥發(fā)揮延緩耐藥效應(yīng)的重要靶點，中藥可以抑制其過度激活，日后應(yīng)更加深入地探索該通路被抑制的具體機制。

1.2 抑制促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路

MAPK 是絲-蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，主要有4 個亞群，分別是ERK、c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 激酶和ERK5。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 通路的異常激活是EGFR-TKI 獲得性耐藥產(chǎn)生的重要原因[12]。

姜黃提取物β-欖香烯具有較好的抗耐藥效應(yīng)，聯(lián)合厄洛替尼可以顯著抑制H1975 耐藥細胞生長，推測機制可能與下調(diào)p-ERK、p-EGFR、p-MTOR 表達，促進耐藥細胞凋亡有關(guān)[13]。參芪扶正注射液可以通過降低p-EGFR、p-MEK 和p-ERK 水平，抑制MAPK/甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBP1）通路的激活，促進PC-9/GR 細胞凋亡，從而增強NSCLC 對吉非替尼的敏感性[14]。金花茶提取物可以通過抑制MAPK 和PI3K/AKT 通路發(fā)揮抗NSCLC 的作用，提示其可能具有延緩EGFR-TKI耐藥的潛力[15]。上述結(jié)果表明，中藥可以顯著下調(diào)MAPK 的表達，與EGFR-TKI 聯(lián)合應(yīng)用起到增效的作用，進而延緩耐藥。其中，姜黃、金花茶等藥食同源類中藥的使用將為NSCLC 的防治提供更加安全而多樣的選擇。

1.3 抑制Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）通路

STAT3 是STAT 家族中的一員，可以通過調(diào)控B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）等凋亡相關(guān)蛋白的表達水平來促進腫瘤細胞的增殖、分化，其異常激活往往與獲得性耐藥關(guān)系密切[16]。

Zhou 等[17]發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可以通過降低耐藥肺癌細胞中p-STAT3 的水平發(fā)揮類似siSTAT3 的效應(yīng)，進而激活胱天蛋白酶（caspase）3 等凋亡相關(guān)蛋白，抑制Bcl-2、Ki-67 等抗凋亡蛋白的表達，由此誘導細胞凋亡，增強NSCLC 對厄洛替尼的敏感性。沈存思等[18]將適宜濃度的高良姜素與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于A549 細胞時亦觀察到上述STAT3 磷酸化被抑制的現(xiàn)象，表明JAK-STAT3 可能是中藥延緩一代、二代EGFR-TKI 耐藥的共同靶點。Yu等[19]發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B 可通過上調(diào)miRNA-175p 抑制PC9/GR 細胞中STAT3 活化，降低吉非替尼耐藥細胞的存活率。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方可以通過抑制STAT3 表達，激活凋亡通路，增強吉非替尼的療效。蔡雪婷等[21]發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可在不影響TKI 活性的前提下，通過抑制STAT3 提高肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。綜上所述，中藥通過抑制JAK/STAT3 通路，可以進一步增強EGFR-TKI 的敏感性，有效緩解耐藥。

2 抑制EGFR 旁路代償性激活

除了下游通路外，旁路的代償性激活也是EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性的重要原因。當EGFR 的信號被TKI 阻斷時，其他RTK 通路可因反饋機制而代償性激活或擴增。此時TKI雖然保持著對EGFR的抑制能力，但異常激活的旁路信號仍可促進下游癌基因的表達，使得EGFR-TKI 失去抑制腫瘤的藥理效果。目前研究較為清楚的主要有以下3條途徑。

2.1 抑制細胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）旁路

c-MET 是由原癌基因MET編碼的具有酪氨酸激酶活性的自主磷酸化跨膜受體，參與細胞的增殖、分化、遷移、侵襲等多種生理過程，其大量擴增是EGFR-TKI 獲得性耐藥的最常見機制。陳琦等[22]發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低PC-9 耐藥細胞的存活率，推測機制可能與p-MET 和p-AKT 蛋白表達受抑制有關(guān)。Kim 等[23]發(fā)現(xiàn)，中藥峨?yún)⒌幕钚猿煞秩パ豕砭识舅兀╠eoxypodophyllotoxin，DPT）可以顯著抑制MET 激酶活性，降低p-MET 及其下游蛋白磷酸化erb-b2 受體酪氨酸激酶3（erb-b2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3）的表達水平，從而誘導NSCLC 吉非替尼耐藥株HCC827GR 細胞凋亡。Oh 等[24]發(fā)現(xiàn)，峨?yún)⒌牧硪环N活性成分鬼臼毒素（podophyllotoxin，PPT）也可以通過抑制c-MET 激酶活性誘導吉非替尼耐藥細胞凋亡。Zheng 等[25]發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方通過下調(diào)c-MET的mRNA 水平和啟動子活性，降低c-MET 蛋白的表達量，進而增強厄洛替尼對耐藥NSCLC 細胞的生長抑制作用。以上文獻說明中藥可以通過抑制c-MET基因表達、降低c-MET 激酶活性來改善EGFR-TKI 耐藥。

2.2 抑制AXL 受體酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase，AXL）旁路

AXL 是受體酪氨酸激酶TAM 家族中的一員，介導與腫瘤相關(guān)的多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的激活。研究表明，EGFR-TKI 耐藥的NSCLC 中存在AXL 的異常激活[26]。Lee 等[27]發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可以通過抑制AXL的表達恢復耐藥的NSCLC細胞對吉非替尼的敏感性。Kim 等[28]發(fā)現(xiàn)，槲寄生提取物可以在順鉑耐藥細胞和厄洛替尼耐藥細胞中阻斷生長抑制特異性蛋白6（growth arrest specific 6，GAS6）與配體AXL結(jié)合，同時通過抑制AXL表達來治療耐藥的NSCLC。這些研究以AXL通路為靶點，為克服NSCLC EGFR-TKI的耐藥提供了天然候選藥物。

2.3 抑制其他旁路

Wang 等[29]發(fā)現(xiàn)，丹參酮可以通過顯著降低耐藥細胞株內(nèi)p-血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和p-AKT 的表達來增加其對吉非替尼的敏感性，提示丹參酮逆轉(zhuǎn)耐藥可能與抑制VEGFR2/AKT 途徑有關(guān)。蔣立峰等[30]發(fā)現(xiàn)，將清肺化瘀解毒方和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于吉非替尼獲得性耐藥細胞株A549/R 后可以抑制其增殖并誘導凋亡，同時伴有胰島素樣生長因子1 受體（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）蛋白及mRNA 表達的下調(diào)，表明清肺化瘀解毒方逆轉(zhuǎn)耐藥的機制與下調(diào)IGF1R 及其下游通路有關(guān)。

綜上所述，中藥復方或活性成分可通過直接靶向PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT3 等EGFR 下游通路，或抑制c-MET、AXL、VEGFR、IGF1R 等旁路，抑制耐藥腫瘤細胞增殖，增強NSCLC 細胞對EGFR-TKI 的敏感性，從而延緩、改善獲得性耐藥，為NSCLC 的中醫(yī)治療提供了依據(jù)與方向。中藥通過抑制EGFR 下游通路及旁路延緩耐藥的具體機制詳見圖1。

圖1 中藥通過抑制EGFR下游通路及旁路延緩耐藥的作用機制

3 抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT 是上皮細胞通過去分化逐漸獲得間質(zhì)細胞表型的生物學過程，與EGFR-TKI 獲得性耐藥密切相關(guān)。Yuan 等[31]將葫蘆素B 作用于轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的吉非替尼耐藥細胞，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細胞標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白等表達降低，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白等表達升高，說明葫蘆素B 具有抑制耐藥細胞EMT 的功效，機制可能與抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和PI3K/AKT/MTOR 通路有關(guān)。Peng 等[32]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可以阻斷PI3K/AKT/扭曲家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（twist family bHLH transcription factor 1，TWIST1）通路，逆轉(zhuǎn)EMT，增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性。類似地，昆布提取物巖藻黃質(zhì)可以抑制EMT并阻斷PI3K/AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路信號轉(zhuǎn)導，阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以更顯著地抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡[33]。黃芪多糖可以通過降低程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）和SREBP1 的表達，抑制PD-L1/SREBP1/EMT 信號通路，進而抑制EMT 過程，改善肺腺癌細胞對吉非替尼的抵抗[34]。綜上所述，中藥可以通過抑制EMT，抑制腫瘤細胞表型轉(zhuǎn)變，從而延緩EGFR-TKI 耐藥。

4 表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳調(diào)控是當前NSCLC EGFR-TKI 耐藥性研究的熱點。它指的是在不改變EGFR基因序列的前提下，通過基因表達模式的演變，即DNA 甲基化、非編碼RNA 調(diào)控、組蛋白乙?；冗^程，誘導NSCLC 產(chǎn)生耐藥性。研究表明，表觀遺傳改變是NSCLC 靶向治療獲得性耐藥的重要機制之一，針對表觀遺傳的藥物可以在一定程度上延緩或逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI 相關(guān)的獲得性耐藥。

Liu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以通過降低甲基轉(zhuǎn)移酶3，N6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶復合體催化亞基（methyltransferase 3, N6-adenosine-methyltransferase complex catalytic subunit，METTL3）的表達來抑制N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化，從而抑制自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）和自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related protein 7，ATG7）的表達，阻止耐藥腫瘤細胞自噬。此外，Cheng 等[36]發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯還可以通過下調(diào)H3K27 的甲基轉(zhuǎn)移酶zeste2多梳抑制復合體2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）的表達來抑制NSCLC 的干細胞樣特征，進而抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。除了通過抑制甲基化改善耐藥，Dai等[37]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷Ⅳ可以上調(diào)NSCLC細胞中一種NAD+依賴性Ⅲ類脫乙酰酶沉默調(diào)節(jié)蛋白6（sirtuin 6，SIRT6）的mRNA表達，進而誘導NSCLC對吉非替尼的增敏效應(yīng)。Wu等[38]發(fā)現(xiàn)，治癌名方消積湯可能通過抑制HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）的表達，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子Sp1 轉(zhuǎn)錄因子（Sp1 transcription factor，SP1）的表達來增強吉非替尼對肺癌耐藥細胞的生長抑制作用，從長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的角度揭示了中藥改善耐藥的全新分子機制。以上研究說明，中藥可以通過調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白乙?；?、lncRNA表達等方式，調(diào)控表觀遺傳信息，發(fā)揮延緩耐藥的效應(yīng)。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，中藥可以廣泛作用于EGFR 通路上的不同環(huán)節(jié)，從多種途徑緩解EGFR-TKI 獲得性耐藥，提高靶向藥物的普遍療效。然而，目前對于中藥延緩EGFR-TKI 耐藥的實驗研究尚存不足：①在作用機制的研究上，現(xiàn)有實驗對常見的耐藥機制研究較為深入，但缺乏對罕見耐藥靶點的關(guān)注。②在信號通路的研究上，部分實驗僅觀察到中藥抑制某條信號通路的現(xiàn)象，卻沒有進一步探索中藥抑制該信號通路的原因。這使得同一中藥的不同作用機制間很難建立聯(lián)系，不利于系統(tǒng)化研究。未來的研究應(yīng)創(chuàng)新思路，在確保中醫(yī)藥臨床療效的前提下，以多靶點、多通路的模式更加全面、深入地探討中藥改善耐藥的作用機制，為中醫(yī)藥與EGFR-TKI 的聯(lián)合治療方案開拓更加廣闊的應(yīng)用前景。