鄭洪祥，李慶航，李亞男，蔣曦曦，呂建平，張婷娉，王 淼，2

(1.濟寧市第二人民醫(yī)院眼科,山東 濟寧 272000;2.英吉沙縣人民醫(yī)院眼科,新疆 英吉沙 834800)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是慢性高血糖引起的視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥,其病變發(fā)生率較高,是造成視力喪失的重要因素[1-2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變早期毛細血管周細胞丟失和基底膜增厚,進而導致內皮細胞過度增殖,最終誘發(fā)視網(wǎng)膜血管異常生成,形成糖尿病視網(wǎng)膜病變[3]。研究表明,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)高表達會使血管異常生長,導致糖尿病視網(wǎng)膜病變的惡化[4];而抗VEGF藥物可抑制眼底新生血管,阻止糖尿病性黃斑水腫,提高糖尿病視網(wǎng)膜病變遠期預后[5]。微RNA(microRNA,miRNA)是小型、高度保守的非編碼RNA,可結合并降解靶mRNA,或抑制其翻譯,進而調節(jié)轉錄后基因表達。miR-140-5p是由多個核苷酸組成的非編碼RNA,參與胚胎發(fā)育、骨骼代謝、心臟重構、細胞分化等生物學過程,且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn),miR-140-5p可以靶向VEGF調節(jié)血管生成,進而保護缺血性腦損傷及抑制乳腺癌細胞的擴散[6-7]。糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橐暰W(wǎng)膜處的微血管異常生成導致的疾病,miR-140-5p是否通過VEGF調節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜微血管的增生尚有待研究。本課題組前期實驗驗證了miR-140-5p和VEGF可靶向結合,本研究采用高糖培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內皮細胞(human retinal vascular endothelial cells,hRECs)模擬高血糖誘發(fā)視網(wǎng)膜病變,探討miR-140-5p對高糖誘導的hRECs增殖、遷移和成管能力的影響及其靶向VEGF機制,旨在為miR-140-5p治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

7周齡雄性無特定病原體級Sprague Dawley大鼠40只,體質量190～210 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。本研究符合實驗動物倫理,經(jīng)濟寧市第二人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 細胞、主要試劑與儀器

hRECs購自中國科學院上海細胞研究所;達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、青鏈雙抗和總RNA抽提試劑均購自上海白鯊生物科技有限公司,胎牛血清購自美國Gibco公司,miR-140-5p模擬物(miR-140-5p mimics)、陰性對照模擬物(mimics negative control,mimics NC)、VEGF-3′UTR WT序列、VEGF-3′UTR MUT序列由上海亞載生物科技有限公司合成,pmiGLO載體購自上海澤葉生物科技有限公司,雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、Lipofectamine 2000 試劑盒購自美國Invitrogen公司,反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒、二喹啉甲酸法蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份公司,基質膠購自美國BD公司,硝酸纖維素膜購自美國millipore公司,VEGF、β-actin一抗及二抗購自北京博奧森生物技術有限公司,噻唑藍、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司,多聚甲醛、無菌無酶處理水購自上海碧云天生物技術有限公司,二甲基亞砜、氯仿、異丙醇、無水乙醇、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉購自國藥集團化學試劑上海有限公司;8孔腔室載玻片購自美國BD公司,96孔板、6孔板和Transwell小室購自美國Corning公司,Scientific 8000細胞培養(yǎng)箱和VARIOSKAN LUX型全波長酶標儀購自美國Thermo公司,DMI3000B倒置拍照顯微鏡購自德國Leica公司,3K15低溫冷凍離心機購自美國Sigma公司,LightCycler?480II 熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司,一體式化學發(fā)光成像儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將hRECs加入含體積分數(shù)10%胎牛血清和體積分數(shù)1%青鏈雙抗的DMEM中,置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔日換1次培養(yǎng)基,融合度達90%左右時傳代。

1.3.2 細胞轉染

取對數(shù)生長期hRECs,調整細胞密度為1×108L-1,分別接種至6孔板,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h后,待細胞生長至融合度80%～90%時進行轉染:將6孔板中的培養(yǎng)液吸棄,PBS清洗,按照Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒說明書混合工作液后,用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋,每孔加入2 mL工作液后,再加入50 μL miR-140-5p mimics或mimics NC,混合均勻,放入細胞培養(yǎng)箱中轉染24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3.3 細胞分組及處理

(1)取對數(shù)生長期hRECs,分為正常對照組、高糖組;正常對照組細胞調整細胞密度為1×108L-1,取2 mL接種于6孔板中,給予DMEM完全培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;高糖組細胞調整細胞密度為1×108L-1,取2 mL接種于6孔板中,給予含30 mmol·L-1葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。(2)另取“1.3.2”項中轉染miR-140-5p mimics或mimics NC的hRECs 2 mL,調整細胞密度為1×108L-1,接種于6孔板中,分別設為miR-140-5p組、陰性對照 (negative control,NC)組,給予DMEM完全培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。(3)取“1.3.2”項中轉染miR-140-5p mimics的hRECs 2 mL,調整細胞密度為1×108L-1,接種于6孔板中,設為高糖+miR-140-5p組,給予含30 mmol·L-1葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 RT-PCR法檢測各組細胞中miR-140-5p的表達

取“1.3.3”項中培養(yǎng)的各組細胞,胰蛋白酶消化,2 000 r·min-1離心10 min,收集細胞,用總RNA抽提試劑提取總RNA,并使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將cDNA作為模板,以U6為內參基因,應用RT-PCR技術檢測miR-140-5p的Ct值。反應體系:cDNA 2.0 μL,2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 5.0 μL,上下游引物各0.4 μL,無酶水2.2 μL。反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,65 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,miR-140-5p上游引物序列為5′-CGGACAGTGGTTTTACCC-3′,下游引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-△△Ct法計算miR-140-5p的相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.3.5 噻唑藍法測定各組細胞增殖能力

取“1.3.3”項中培養(yǎng)的各組細胞,調整細胞濃度為5×107L-1,每孔200 μL接種于96孔板,每組設8個復孔,置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24、48、72 h,每孔加入5 g·L-1噻唑藍溶液20 μL,繼續(xù)孵育4 h后,棄去孔內上清液,每孔加入200 μL 二甲基亞砜,室溫振蕩5 min,結晶物充分溶解后,用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度值,以吸光度值代表細胞增殖能力,吸光度值越高代表增殖能力越高,計算細胞增殖率(細胞增殖率=處理組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%)。實驗重復3次,取均值。

1.3.6 Transwell法測定各組細胞遷移能力

取“1.3.3”項中培養(yǎng)的各組細胞,更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,胰蛋白酶消化細胞后用無血清培養(yǎng)液重懸,于Transwell小室中加入300 μL濃度為1×108L-1的無血清細胞懸液后,將Transwell小室置于24孔板上,再向24孔板中每孔加入600 μL完全培養(yǎng)基,每組設3個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室,棄去Transwell小室內液體,PBS漂洗2次,用棉簽擦拭掉Transwell小室底膜上層細胞,對Transwell小室底膜下層細胞用預冷的40 g·L-1多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色10 min,隨機選取5個視野進行顯微鏡拍照并計數(shù)遷移細胞數(shù),取均值。遷移細胞數(shù)越多表示細胞遷移能力越強。

1.3.7 管腔形成實驗測定各組細胞成管能力

4 ℃下融化基質膠,于8孔腔室載玻片中每孔加入10 μL基質膠,然后將8孔腔室載玻片置于含少量水的培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min,使基質膠凝固。將“1.3.3”項中培養(yǎng)24 h的各組細胞,更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,胰蛋白酶消化細胞后用無血清培養(yǎng)液重懸至2×108L-1,加入到鋪好基質膠的8孔腔室載玻片中,每孔50 μL,每組設3個復孔,置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)8 h后,顯微鏡下觀察,隨機選取5個視野拍照并計數(shù)形成管腔數(shù),取均值。以管腔數(shù)量表示細胞的成管能力,管腔數(shù)越多表示細胞成管能力越強。

1.3.8 Western blot 法檢測各組細胞中VEGF蛋白的表達

取“1.3.3”項中培養(yǎng)24 h的各組細胞,用預冷PBS漂洗3遍,加入含蛋白酶抑制劑的預冷裂解液,充分震蕩,置于冰上靜置30 min,細胞刮收取細胞后,4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,取上清,使用二喹啉甲酸法測定上清液蛋白濃度,沸水浴10 min使蛋白充分變性。取每組蛋白樣品30 μg,用體積分數(shù)12%分離膠進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳電壓為恒壓60 V,之后將蛋白采用350 mA 恒流電轉移2 h至硝酸纖維素膜上,取出硝酸纖維素膜,使用5 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃一抗(VEGF、β-actin;滴度為11 000)孵育12 h,緩沖液洗膜后加二抗(滴度為12 000)室溫孵育1 h,緩沖液沖洗后進行電化學發(fā)光,用一體式化學發(fā)光成像儀拍照并分析灰度值,VEGF蛋白相對表達量以VEGF條帶灰度值與內參(β-actin)灰度值的比值表示。實驗重復3次,取均值。

1.3.9 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察 miR-140-5p對糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜血管生成的影響

按隨機數(shù)字表法將40只SD大鼠分為正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病+NC組和糖尿病+miR-140-5p組,每組10只。正常對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(10 mL·kg-1);糖尿病模型組、糖尿病+miR-140-5p組和糖尿病+NC組大鼠腹腔注射6.5 g·L-1鏈脲佐菌素(10 mL·kg-1),7 d后大鼠血糖值>16.7 mmol·L-1為造模成功。第8天,正常對照組和糖尿病模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μL生理鹽水,糖尿病+NC組大鼠經(jīng)尾靜脈注射 200 μL mimics NC(200 nmol·L-1),糖尿病+miR-140-5p組大鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μL miR-140-5p mimics(200 nmol·L-1),每日1次,持續(xù)給藥7 d。大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8周后,腹腔注射3 g·L-1戊巴比妥鈉(10 mL·kg-1)麻醉大鼠,快速完整摘除右眼球,置于多聚甲醛固定液中,3 d后用PBS洗滌3次,用尖頭鑷子去除前眼角膜和晶狀體,PBS 溶液沖洗掉玻璃體,剝離出內壁的視網(wǎng)膜層,胰蛋白酶消化,再用生理鹽水反復沖洗視網(wǎng)膜,以去除黏附在視網(wǎng)膜血管網(wǎng)上的細胞,直至視網(wǎng)膜中的血管網(wǎng)呈現(xiàn)透明狀,將視網(wǎng)膜轉移至石蠟防脫玻片上,使視網(wǎng)膜完全展開,自然晾干后,HE染色,脫水,透明,中性樹脂封固,鏡下觀察比較各組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管病變情況。當大鼠視網(wǎng)膜血管整體呈“樹狀結構”,視盤處毛細血管分布較致密均勻,外極部毛細血管分布較疏松,為正常視網(wǎng)膜血管形態(tài);當大鼠視網(wǎng)膜血管整體“樹狀結構”被破壞,毛細血管分布不均勻,出現(xiàn)毛細血管瘤,為糖尿病視網(wǎng)膜病變。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 5組細胞中miR-140-5p相對表達量比較

正常對照組、高糖組、miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量分別為1.00±0.05、0.49±0.09、3.70±0.21、1.04±0.08、0.83±0.06。5組細胞中miR-140-5p相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=389.100,P<0.01)。高糖組、高糖+miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量顯著低于正常對照組,miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);NC組與正常對照組細胞中miR-140-5p相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量顯著高于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量顯著低于miR-140-5p組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高糖+miR-140-5p組細胞中miR-140-5p相對表達量顯著低于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 5組細胞增殖能力比較

培養(yǎng)24、48、72 h時,5組細胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計學意義(F=5.629、32.410、55.430,P<0.01)。培養(yǎng)24、48、72 h時,高糖組細胞增殖率均顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);miR-140-5p組、NC組與正常對照組細胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培養(yǎng)24 h時,高糖+miR-140-5p組與正常對照組細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);培養(yǎng)48、72 h時,高糖+miR-140-5p組細胞增殖率顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。培養(yǎng)24、48、72 h時,miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞增殖率均顯著低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時,NC組與miR-140-5p組細胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培養(yǎng)24 h時,高糖+miR-140-5p組與miR-140-5p組、NC組細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);培養(yǎng)48、72 h 時,高糖+miR-140-5p組細胞增殖率顯著高于miR-140-5p組和NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見表1。

表1 5組細胞增殖能力比較

2.3 5組細胞遷移能力比較

正常對照組、高糖組、miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組遷移細胞數(shù)分別為83.00±9.17、175.00±8.00、29.33±4.04、62.67±5.03、82.00±6.00。5組遷移細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=194.400,P<0.01)。高糖組遷移細胞數(shù)顯著高于正常對照組,miR-140-5p組、NC組遷移細胞數(shù)顯著低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高糖+miR-140-5p組與正常對照組遷移細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組遷移細胞數(shù)顯著低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NC組、高糖+miR-140-5p組遷移細胞數(shù)均顯著高于miR-140-5p組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高糖+miR-140-5p組遷移細胞數(shù)顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖1。

A:正常對照組;B:高糖組;C:miR-140-5p組;D:NC組;E:高糖+miR-140-5p組。

2.4 5組細胞成管能力比較

正常對照組、高糖組、miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞管腔形成數(shù)量分別為102.70±7.64、165.70±9.45、61.33±6.03、77.33±5.69、102.00±9.54。5組細胞管腔形成數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=75.520,P<0.01)。高糖組管腔形成數(shù)量顯著高于正常對照組,miR-140-5p組、NC組細胞管腔形成數(shù)量顯著低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);高糖+miR-140-5p組與正常對照組細胞管腔形成數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞管腔形成數(shù)量均顯著低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NC組、高糖+miR-140-5p組細胞管腔形成數(shù)量均顯著高于miR-140-5p組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖+miR-140-5p組細胞管腔形成數(shù)量顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

A:正常對照組;B:高糖組;C:miR-140-5p組;D:NC組;E:高糖+miR-140-5p組。

2.5 5組細胞中VEGF蛋白相對表達量比較

正常對照組、高糖組、miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量分別為1.00±0.09、2.34±0.17、0.46±0.04、1.10±0.11、1.47±0.27。5組細胞中VEGF蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=58.080,P<0.01)。高糖組、高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著高于正常對照組,miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);NC組與正常對照組細胞中VEGF蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-140-5p組、NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NC組、高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量均顯著高于miR-140-5p組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖3。

1:正常對照組;2:高糖組;3:miR-140-5p組;4:NC組;

2.6 miR-140-5p對糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜血管生成的影響

正常對照組大鼠靠近視乳頭處的視網(wǎng)膜血管整體呈“樹狀結構”,內極部毛細血管分布較致密,外極部毛細血管分布較疏松,血管壁均勻(圖4A)。糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜血管的“樹狀結構”被破壞,毛細血管分布不均勻,毛細血管瘤形成(圖4B)。糖尿病+NC組大鼠視網(wǎng)膜血管損傷與糖尿病模型組相當(圖4C)。糖尿病+miR-140-5p組大鼠視網(wǎng)膜血管的損傷情況有所好轉,毛細血管分布較均勻,毛細血管瘤減少(圖4D)。

A:正常對照組;B:糖尿病模型組;C:糖尿病+NC組;D:糖尿病+miR-140-5p組。

3 討論

2020年糖尿病視網(wǎng)膜病變患者約為1.03億人,預計到2045年其將增加至約1.61億人[8]。但糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制和診療措施仍不十分明確,有待繼續(xù)研究[9]。多種miRNA和細胞因子參與視網(wǎng)膜血管內皮細胞的病變,選擇有效靶點成為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的關鍵。

高糖培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內皮細胞是目前糖尿病視網(wǎng)膜病變研究的重要模型之一[10]。高血糖條件下多種miRNA表達異常,是誘發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變的基礎[11-12]。miR-140-5p對多種疾病具有調控作用,如GUO等[13]研究發(fā)現(xiàn),敲除miR-140-5p可以促進大鼠骨髓干細胞的成骨作用;TOURY等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-140-5p在抗衰老中具有重要作用;ZHANG等[15]研究顯示,上調miR-140-5p可減輕小鼠關節(jié)炎的發(fā)生。本研究采用高糖培養(yǎng)條件誘導hRECs損傷,并探討miR-140-5p在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用,結果顯示,高糖組hRECs細胞中miR-140-5p 相對表達量顯著低于正常對照組,提示高糖培養(yǎng)會降低hRECs細胞中miR-140-5p的表達;miR-140-5p組hRECs細胞中miR-140-5p相對表達量顯著高于正常對照組,而NC組hRECs細胞中miR-140-5p相對表達量與正常對照組相比無顯著變化,說明hRECs細胞轉染miR-140-5p成功;此外,高糖+miR-140-5p組hRECs細胞中miR-140-5p相對表達量顯著高于高糖組,提示轉染miR-140-5p后的hRECs細胞在高糖培養(yǎng)條件下仍然高表達miR-140-5p。

有研究顯示,高糖環(huán)境下hRECs的增殖、遷移和成管能力增加[16-17],這可能是糖尿病視網(wǎng)膜血管病變的細胞學基礎。機體內的血糖水平會隨著飲食和晝夜節(jié)律變化而波動,當機體糖代謝系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂時,體內血糖處于持續(xù)高水平狀態(tài),會對視網(wǎng)膜等血管內皮細胞的生長產生促進作用[18],這可能是hRECs細胞在高糖培養(yǎng)條件下增殖、遷移和成管能力增強的原因。因此,抑制高糖環(huán)境下hRECs生物學特性的異常改變,將對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變產生積極作用。本研究進一步觀察了高糖培養(yǎng)及miR-140-5p對hRECs細胞增殖、遷移和管腔形成的影響,結果顯示,高糖組hRECs細胞的增殖、遷移和成管能力均顯著高于正常對照組;而高糖+miR-140-5p組hRECs細胞的增殖能力、遷移能力和成管能力則均顯著低于高糖組,說明hRECs細胞轉染miR-140-5p后可以緩解高糖造成的細胞損傷,提示miR-140-5p可能具有調節(jié)視網(wǎng)膜血管的作用,這為開發(fā)基于miR-140-5p治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物提供了參考。

VEGF過表達是糖尿病視網(wǎng)膜微血管病理性增生的重要原因之一。研究顯示,糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視網(wǎng)膜色素上皮細胞中VEGF蛋白水平顯著增加[19]。而VEGF高表達可進一步促進血管的異常生長,導致糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[20]。抗VEGF藥物治療可顯著提高視網(wǎng)膜病變患者視力[21]。本研究結果顯示,高糖組hRECs細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著高于正常對照組,而高糖+miR-140-5p組細胞中VEGF蛋白相對表達量顯著低于高糖組;提示高糖誘導會導致VEGF的表達增高,而miR-140-5p水平的增高會抑制VEGF的表達,miR-140-5p可能是通過靶向VEGF調控hRECs細胞免受高糖損傷。以上結果初步提示,miR-140-5p是通過靶向減少VEGF表達來調控hRECs的增殖、遷移和成管能力。

糖尿病視網(wǎng)膜病變早期特征為視網(wǎng)膜血管內皮細胞損傷,晚期病理改變?yōu)槲⒀芰鲆约靶律艿男纬蒣22]。PARK等[23]研究發(fā)現(xiàn),鏈脲佐菌素選擇性破壞大鼠胰島β細胞,使大鼠持續(xù)高血糖,8周后會產生早期的視網(wǎng)膜病變。TROST等[24]報道,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管結構損傷、毛細血管分布改變、毛細血管瘤形成的可能原因為長期高血糖造成視網(wǎng)膜毛細血管的周細胞減少及內皮細胞增生所致。為驗證miR-140-5p對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療作用,本研究構建了鏈脲佐菌素誘導的大鼠糖尿病模型,結果顯示,正常對照組大鼠靠近視乳頭處的視網(wǎng)膜血管整體呈“樹狀結構”,內極部毛細血管分布較致密,外極部毛細血管分布較疏松,血管壁均勻;糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜血管的“樹狀結構”被破壞,毛細血管分布不均勻,毛細血管瘤形成;糖尿病+NC組大鼠視網(wǎng)膜血管損傷與糖尿病模型組相當;糖尿病+miR-140-5p組大鼠視網(wǎng)膜血管的損傷情況有所好轉,毛細血管分布較均勻,毛細血管瘤減少。給予miR-140-5p干預后,大鼠視網(wǎng)膜血管的損傷好轉。以上結果說明,高糖會造成hRECs增殖、遷移和成管能力增加,這可能是糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管病理改變的細胞學基礎;而miR-140-5p干預后,會顯著抑制高糖誘導的hRECs增殖、遷移和成管能力,使大鼠視網(wǎng)膜血管免受高糖的損傷。

4 結論

miR-140-5p可以抑制hRECs在高糖條件下的增殖、遷移及成管能力,緩解糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管病變,其作用可能是通過miR-140-5p靶向調控VEGF的表達而實現(xiàn)。