張雅楠 許鋒,2

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021; 2.上海交通大學(xué) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,上海 200011)

2022年美國心臟協(xié)會(huì)發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,直到2019年心血管疾病仍占美國心臟病死亡人數(shù)的41%[1]。心肌梗死(myocardial infarction,MI)后導(dǎo)致的心力衰竭,依舊是許多心血管疾病患者的主要死亡原因之一。在MI發(fā)生后,炎癥細(xì)胞浸潤缺血的心肌,隨之該缺血部位的心肌被纖維組織取代,產(chǎn)生嚴(yán)重的心室重塑,進(jìn)而發(fā)生心律失常和心力衰竭,從而增加心血管疾病患者的死亡率[2]。因此有必要開發(fā)新的治療方法來改善MI患者的長期預(yù)后。

隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程的不斷發(fā)展和成熟,由于生物材料具有良好的組織相容性和生物活性,受到研究者們廣泛關(guān)注。其中,通過對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理,去除其細(xì)胞成分和抗原后得到的脫細(xì)胞基質(zhì)(decellularized extracellular matrix,dECM),有效地保存了心臟組織中的蛋白質(zhì)、糖胺聚糖、蛋白多糖和其他的基質(zhì)成分以及細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),可為受損心肌的修復(fù)、再生和重塑提供有利的條件,成為用于心臟修復(fù)和再生的組織工程材料[3]。

相對于心臟補(bǔ)片等創(chuàng)傷性較強(qiáng)的心肌修復(fù)材料,可注射的水凝膠材料則可通過微創(chuàng)注射的方式直接將材料或細(xì)胞成分輸送到梗死部位,具有微創(chuàng)、可定位定量、安全性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。dECM水凝膠是指通過對脫細(xì)胞后產(chǎn)生的dECM進(jìn)行凝膠化之后形成的膠狀大分子生物材料,相比于dECM本身,dECM水凝膠增加了微創(chuàng)性和可注射性的優(yōu)點(diǎn),可直接作用于受損的心肌組織。現(xiàn)就dECM水凝膠的制備及其對心臟修復(fù)再生的作用進(jìn)行綜述。

1 dECM水凝膠的制備

1.1 脫細(xì)胞過程

脫細(xì)胞過程,是指在盡量保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)的成分、三維空間結(jié)構(gòu)的完整性以及盡量不損失細(xì)胞外基質(zhì)中有利于細(xì)胞生存的生長因子的情況下,有效去除組織和器官中的細(xì)胞成分,尤其是DNA、RNA和一些引起免疫反應(yīng)的抗原等。目前大部分的脫細(xì)胞方法都集中于采用物理法、化學(xué)法和酶法[4]。物理法主要包括凍融循環(huán)、灌注、攪拌、刮除、剪碎等[5]?；瘜W(xué)法是使用酸堿溶液、去污劑、高滲或低滲溶液對組織或器官進(jìn)行脫細(xì)胞處理[6]。酶法通常會(huì)使用一些生物酶,如蛋白酶、核酸酶等,通過破壞細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接,或者破壞細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接,從而能高度特異地去除組織或器官中的細(xì)胞成分[7]。詳見表1。

表1 dECM的制備方法、原理以及優(yōu)缺點(diǎn)

雖然這3種方法都有自己本身的優(yōu)點(diǎn),但單獨(dú)使用其中任何一種方法,都難以獲得純化的dECM,因此需聯(lián)合使用各種方法以達(dá)到脫細(xì)胞過程所要求的完全能去除細(xì)胞成分和抗原,并最大程度地保留細(xì)胞外基質(zhì)的原始結(jié)構(gòu)、組分以及理化特性的最終目的[8-9]。

在2008年,Ott等[10]的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)就對大鼠的心臟進(jìn)行了通過冠狀動(dòng)脈灌注脫細(xì)胞,并且成功獲得完整的心臟脫細(xì)胞支架,開拓了心臟脫細(xì)胞的先河。在這項(xiàng)里程碑的實(shí)驗(yàn)之后,心臟脫細(xì)胞技術(shù)在組織工程領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展。

之后的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),對SD大鼠的心臟采用1%十二烷基磺酸鈉逆行灌注6 h,1% 曲拉通 X-100密閉灌注0.5 h后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌,在對心臟連續(xù)灌注4 d后,獲得心臟dECM[11]。此方法不僅保存了原本心臟的幾何形狀以及大部分細(xì)胞外基質(zhì)成分,并且在后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其能正向調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性,有利于心肌修復(fù)。

除此之外,通過負(fù)壓吸引的真空輔助裝置進(jìn)行脫細(xì)胞,可驅(qū)動(dòng)用于脫細(xì)胞試劑的流動(dòng),達(dá)到對組織和器官的細(xì)胞快速洗脫的目的,獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)與原始組織器官更加相似的脫細(xì)胞支架[12-13]。從SD大鼠到豬的心臟脫細(xì)胞,一步步地發(fā)展改進(jìn),現(xiàn)已可獲得人類的心臟脫細(xì)胞[14]。

除全心臟脫細(xì)胞外,按照使用的具體需求,如果不需要保存完整的心臟脫細(xì)胞支架,更加方便的方式是對部分心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理,如將心臟進(jìn)行切片之后進(jìn)行脫細(xì)胞處理,利用化學(xué)試劑或者酶進(jìn)行浸泡攪拌等,從而獲得dECM[15-20]。雖然可能由于心臟組織來源的不同、解剖位置及大小等的差異[21],導(dǎo)致這些實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)使用了并不完全相同的脫細(xì)胞方法。但對于心臟進(jìn)行取材、切除一些脂肪組織和脈管系統(tǒng)、保留心室、將保留的組織切片采用十二烷基磺酸鈉和曲拉通X-100進(jìn)行攪拌和浸泡處理等這些步驟,還是相對統(tǒng)一的。

正因如此,應(yīng)在脫細(xì)胞的過程中不斷摸索出最佳方式和最佳時(shí)間,優(yōu)化物理法、化學(xué)法和酶法脫細(xì)胞方法的組合模式,以尋求一套相對標(biāo)準(zhǔn)的心臟組織脫細(xì)胞流程。

1.2 基于dECM的水凝膠制備

dECM水凝膠的形成是一個(gè)自組裝的過程[15],它主要依賴細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分,但同時(shí)也受到其他的蛋白成分、糖胺聚糖以及蛋白多糖的影響。

dECM自組裝成水凝膠的過程主要包括以下兩個(gè)部分:將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的dECM冷凍干燥成粉末狀,并通過酸和酶的作用將其酶解成液體;之后調(diào)節(jié)dECM溶液的溫度、酸堿度或者加入一些交聯(lián)劑從而誘導(dǎo)使其成為穩(wěn)定的水凝膠[22]。

在2009年,Singelyn等[23]首次將dECM進(jìn)行凝膠化,詳細(xì)測定了dECM水凝膠的組分及其含量,證明其保留了dECM材料本身的許多優(yōu)點(diǎn),并有很好的應(yīng)用前景。該團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn),dECM溶解后產(chǎn)生的預(yù)凝膠溶液具有很強(qiáng)的溫度敏感性,在4 ℃時(shí)為溶液形式,當(dāng)溫度提高至37 ℃的生理溫度條件下,則可形成穩(wěn)定的dECM水凝膠。在臨床實(shí)踐中,可將液態(tài)的dECM預(yù)凝膠通過注射器注射至MI部位,生理溫度下使其自組裝成水凝膠貼附在MI部位并進(jìn)行修復(fù)作用。在2012年,該團(tuán)隊(duì)利用導(dǎo)管注射dECM水凝膠到MI部位后,顯著增加了心肌細(xì)胞數(shù)量和增強(qiáng)了心臟收縮能力,進(jìn)一步證明dECM水凝膠可用于MI治療[24]。

雖然dECM本身可自組裝成水凝膠,但由于脫細(xì)胞的程度不同,導(dǎo)致脫細(xì)胞后的dECM存留的膠原、多糖、蛋白等成分的含量不同,進(jìn)行凝膠化后,單獨(dú)的dECM水凝膠的力學(xué)性能較差,可能機(jī)械性能或者黏附性并不能達(dá)到研究者想要的效果,所以很多研究者在基于dECM水凝膠本身優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上,通過摻入其他材料與其聯(lián)合使用,形成了dECM復(fù)合水凝膠,相較于單一組分的dECM水凝膠,在很多方面達(dá)到了一加一大于二的效果[25],隨著3D打印技術(shù)的成熟和發(fā)展,復(fù)合水凝膠可作為3D打印的生物墨水使用,也使其具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

Curley等[26]用藻酸鹽聯(lián)合dECM水凝膠進(jìn)行改進(jìn),顯示出該復(fù)合水凝膠比單一組分的dECM水凝膠具有更好的流變學(xué)特性、機(jī)械性能以及更高的代謝活性。心臟本身具有一定的電生理,在此基礎(chǔ)上,摻入還原性氧化石墨烯,制成導(dǎo)電的dECM水凝膠,用于改變心臟的微生理系統(tǒng),二者共同作用產(chǎn)生協(xié)同效果,改善了心臟功能[16],此法使dECM水凝膠的導(dǎo)電性更強(qiáng),更加貼合心臟電生理。

由于dECM水凝膠本身可為周圍組織提供一定的結(jié)構(gòu)支撐和生物活性,也可用于輸送小顆粒和/或細(xì)胞,以改善它們在注射部位的保留[27],如將細(xì)胞外囊泡摻入到聚乙二醇-dECM水凝膠中,在保持dECM水凝膠可注射性和生物降解性的同時(shí)提高了機(jī)械性能,使得細(xì)胞外囊泡能更好地保存到體內(nèi),解決了單獨(dú)使用其中任何一個(gè)組分的限制,可顯著提高治療效果[17]。

2 dECM水凝膠對心臟修復(fù)的作用

MI是一種由于冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致心肌供血不足,從而使組織缺氧造成心肌細(xì)胞死亡和組織壞死的缺血性疾病,心臟壞死的部分會(huì)很快被成纖維細(xì)胞替代,形成瘢痕組織,導(dǎo)致心室重塑,喪失心肌組織本身的功能并降低收縮性[28], 因此利用dECM水凝膠對于MI的治療,很重要的一點(diǎn)就是預(yù)防早期心室重塑并盡量修復(fù)MI后的心肌組織,恢復(fù)其本身的功能。

dECM成分對心臟修復(fù)的作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)經(jīng)過脫細(xì)胞過程后,保留的機(jī)械特性可使dECM在心臟連續(xù)收縮以及舒張期間能抵抗強(qiáng)度,從而使梗死區(qū)域保持穩(wěn)定;(2)dECM對細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分以及膠原和多糖的保留,可有效調(diào)節(jié)梗死區(qū)域細(xì)胞的黏附和分化;(3)dECM中還保留了心肌內(nèi)的一些特異性因子,比如血管生成因子,可促進(jìn)微血管的形成,從而驅(qū)動(dòng)組織的特異性分化[29],有利于維持MI后心臟的穩(wěn)態(tài)[30-31]。因此,無論是單獨(dú)使用dECM還是與其他細(xì)胞或者細(xì)胞因子相互結(jié)合共同作用,都可通過內(nèi)源性修復(fù)來促進(jìn)血管的形成,改善和修復(fù)受損的心肌。

大量研究明確表明,無論是急性MI還是慢性MI[32],在梗死之后使用dECM,可抑制成纖維細(xì)胞的活化[33],減少纖維瘢痕的擴(kuò)張和防止不良的心室重塑,降低纖維化,增強(qiáng)心臟功能;并且在MI部位促進(jìn)局部血運(yùn)重建、心肌細(xì)胞分化和增殖[34]。

2.1 單一組分dECM水凝膠

為研究胎兒心臟和成人心臟細(xì)胞外基質(zhì)的差別,將脫細(xì)胞新生小鼠的心臟dECM水凝膠和成年小鼠的dECM水凝膠對比,發(fā)現(xiàn)來自新生小鼠的dECM水凝膠確實(shí)對MI小鼠有更好的治療作用,可有效預(yù)防MI后的廣泛心室重塑,并且確定了ErbB 信號通路是誘導(dǎo)改善的重要組成部分[34]。

此外,利用電噴霧法制作的dECM水凝膠微粒顯示出了更好的穩(wěn)定性,它具有比dECM水凝膠本身更加緩慢的大分子釋放動(dòng)力學(xué),不僅保留了dECM水凝膠本身對梗死部位的作用效果,也可考慮將其作為MI后藥物輸送后進(jìn)行緩釋的平臺[15]。

直接注射dECM水凝膠可利用細(xì)胞外基質(zhì)本身的特性對MI進(jìn)行修復(fù),目前已有了臨床轉(zhuǎn)化的案例。臨床研究[35]證明,MI后患者的經(jīng)心內(nèi)膜注射使用脫細(xì)胞的豬細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠——VentriGel,在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的安全性和可行性,這是dECM水凝膠第一次在MI后臨床上的使用,對于dECM水凝膠的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

單獨(dú)dECM水凝膠的使用,使研究者們看到dECM作為一種基礎(chǔ)的生物材料,有很強(qiáng)的可塑性和臨床轉(zhuǎn)化的潛力,但由于脫細(xì)胞效率難以定量控制,不同批次的dECM中殘留的細(xì)胞因子并不完全相同,作用效果并不十分穩(wěn)定。

2.2 攜干細(xì)胞及細(xì)胞衍生物的dECM水凝膠

隨著對dECM的不斷了解和深入研究,dECM材料已成為了一種原料,不僅局限于其單獨(dú)使用,也可作為一種心臟內(nèi)給藥的載體。近幾年來,細(xì)胞療法也是再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)關(guān)注的一個(gè)方向。但由于活細(xì)胞本身較為脆弱,將其直接注射至MI部位后可能會(huì)造成細(xì)胞污染、移植壽命較短、微血管阻塞等一系列問題,很難直接輸送到心肌梗死患者體內(nèi)進(jìn)行原位治療,所以將dECM水凝膠作為干細(xì)胞傳輸?shù)钠脚_,可為細(xì)胞療法提供載體支持。

棕色脂肪干細(xì)胞與dECM水凝膠在體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)表明,dECM水凝膠促進(jìn)了棕色脂肪干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的成熟和分化;并且在進(jìn)行心肌移植之后,dECM水凝膠也增強(qiáng)了棕色脂肪干細(xì)胞在MI部位的駐留和心肌的再生[11]。Waters等[36]將dECM水凝膠作為間充質(zhì)干細(xì)胞的載體,將其注入梗死部位后,在梗死部位顯示出良好的心臟新生血管的再生,減小了瘢痕組織的面積,增強(qiáng)了心臟再生的能力。另有團(tuán)隊(duì)將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與dECM水凝膠通過心包內(nèi)注射,在MI部位原位形成貼片,通過旁分泌以及直接分化,對缺血性心肌產(chǎn)生修復(fù)的作用,并且有效降低了心包內(nèi)直接注射細(xì)胞的方式而產(chǎn)生的免疫原性[37]。

無論是棕色脂肪干細(xì)胞還是間充質(zhì)干細(xì)胞和多能干細(xì)胞,與dECM水凝膠結(jié)合使用,都能有效避免細(xì)胞直接注射進(jìn)行MI修復(fù)的弊端。dECM水凝膠可作為干細(xì)胞的支持物和媒介,在注射后可維持干細(xì)胞在梗死部位的存活,并且結(jié)合dECM水凝膠本身可對心肌進(jìn)行修復(fù)的特點(diǎn),這將成為一種很有前途的治療MI的方式。

此外,外泌體作為干細(xì)胞的衍生物,也可將其與dECM水凝膠相結(jié)合使用,使外泌體很好地保留在MI部位原位并發(fā)揮作用,顯著提高治療效果[17]。

無論是與干細(xì)胞結(jié)合還是作為外泌體的載體,dECM水凝膠都表現(xiàn)出良好的生物相容性和組織活性,細(xì)胞直接注射雖然有其明確的治療效果,但是無法保證注射后的存活率和在MI部位的保留效率;由于dECM水凝膠的特點(diǎn),注射后可保留在梗死部位,使其攜帶的物質(zhì)產(chǎn)生更為穩(wěn)定的修復(fù)作用。

3 總結(jié)與討論

dECM有復(fù)雜的天然結(jié)構(gòu),并且具有很強(qiáng)的生物相容性,dECM的成分可影響細(xì)胞的生長、組織的再生以及血運(yùn)的重建,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很強(qiáng)大的應(yīng)用前景。

既往的許多研究已表明,dECM材料可應(yīng)用于MI的治療,但在臨床轉(zhuǎn)化的過程中,仍有許多問題亟待解決:(1)標(biāo)準(zhǔn)化dECM的制備,不完全的脫細(xì)胞過程獲得的dECM水凝膠,或者脫細(xì)胞后的dECM中有化學(xué)成分的殘留,可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生注射后嚴(yán)重的免疫反應(yīng),需制定標(biāo)準(zhǔn)的脫細(xì)胞方案,既可保證細(xì)胞完全洗脫,又不影響dECM的機(jī)械性能;(2)目前的研究中,還未明確地解釋清楚dECM對于細(xì)胞微環(huán)境的作用和影響,dECM在體內(nèi)降解之后對于組織生長的細(xì)胞分子機(jī)制也尚不明確;(3)現(xiàn)有的許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的,所研究出的dECM水凝膠究竟是否能真正地實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)商品化的生產(chǎn),也是dECM目前面臨的一個(gè)考驗(yàn)。

dECM材料本身就有很強(qiáng)的可塑性,可與3D打印技術(shù)、靜電紡絲以及水凝膠進(jìn)行結(jié)合,并且在骨骼、神經(jīng)等領(lǐng)域已有了相對成熟的研究[38-39]。目前在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,dECM也可用作3D打印的生物墨水,對MI后的部位進(jìn)行修復(fù)和發(fā)揮作用[40-42]。