常月賞，蘭公劍，王闊，陶蕾

HPLC法測定阿瑞匹坦中基因毒性雜質(zhì)3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮

常月賞，蘭公劍*，王闊，陶蕾

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

建立了液相色譜法測定阿瑞匹坦基因毒性雜質(zhì)3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的分析方法。采用安捷倫Poroshell 120系列EC-C18柱為色譜柱，0.1%磷酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm。結(jié)果表明：溶劑空白及主峰不干擾該雜質(zhì)的測定；該雜質(zhì)在限度濃度20%～200%的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；該雜質(zhì)的回收率在99.3%～101.0%范圍內(nèi)，小于5.0%；對照品溶液及供試液在室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性和中間精密度均小于5.0%。本方法專屬性及精密度好，準(zhǔn)確度高，可以用于本品中基因毒性雜質(zhì)3-氯甲 基-1,2,4-三唑啉-5-酮的檢測。

阿瑞匹坦；基因毒性雜質(zhì)；3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮；液相色譜法（HPLC）

阿瑞匹坦與其他止吐藥物聯(lián)合用藥，適用于預(yù)防高度致吐性抗腫瘤化療的初次和重復(fù)治療過程中出現(xiàn)的急性和遲發(fā)性惡心和嘔吐[1-6]。阿瑞匹坦具有全新的藥理作用機制，其作為首個神經(jīng)激肽-1（NK-1）受體拮抗劑為預(yù)防和治療癌癥患者化療引起的惡心嘔吐提供了更多的藥物治療選擇[7-9]。

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮是合成阿瑞匹坦的關(guān)鍵物料，屬三唑啉酮類衍生物[10]。3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮為單鹵代烷烴化合物[11-12]，依據(jù)ICH M7，該化合物具有基因警示結(jié)構(gòu)。阿瑞匹坦為腫瘤輔助間歇用藥，每日最大給藥劑量為125mg，服用周期一般在1～12月內(nèi)。該化合物無明確的TD50，最大允許日攝入量按20 μg來計算，其限度為160 μg·g-1。本文擬建立一種液相色譜分析方法，用于阿瑞匹坦原料藥中基因毒性雜質(zhì)3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的控制，以保證用藥安全性。

1 實驗部分

1.1 儀器

液相色譜儀，型號1260，安捷倫；電子天平，型號ME36S，賽多利斯；有機針頭濾器，材質(zhì)為尼龍，型號13 mm×0.22 μm，南京榮華科學(xué)器材有限公司；離心機，SIGMA型號3-18K。

1.2 試藥

供試品阿瑞匹坦，批號138181001，南京正大天晴制藥有限公司；雜質(zhì)3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮對照品，批號YY18080202，江蘇宇田醫(yī)藥有限公司；磷酸、甲醇、乙腈，均為色譜級。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相A為0.1%磷酸溶液（取磷酸1 mL，加水1 000 mL，混勻），流動相B為乙腈。色譜柱廠家為安捷倫，型號Poroshell 120系列 EC-C18柱，內(nèi)徑為4.6 mm，長度為10 cm，粒徑為2.7 μm。流速為1.0 mL·mim-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為 210 nm。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

溶劑：0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）。

對照品貯備液：精密稱取3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮對照品約16 mg，置100 mL量瓶中，加適量0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）溶解后定容至刻度線，搖勻，量取該貯備液1 mL，置100 mL的容量瓶中，加0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定容，搖勻。

對照品溶液：取對照品貯備液2.00 mL，置 20 mL的容量瓶中，加0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定容，搖勻。

供試液：取本品約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾。

加標(biāo)供試液：取本品約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，精密加入雜質(zhì)貯備液2 mL，再用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。

2.3 專屬性

取溶劑空白（0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）、對照品溶液和供試液各20 μL進(jìn)樣分析。對結(jié)果進(jìn)行分析，溶劑空白和主峰對3-氯甲基-1,2,4-三唑 啉-5-酮的測定無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.4 濾膜吸附考察

取加標(biāo)供試液，分別進(jìn)行離心（1 000 r·min-1，10 min），取上清液；用有機針頭濾器（尼龍66， 13 mm×0.22 μm）分別棄去0、1、2、3、4、5 mL初濾液后，取續(xù)濾液，分別進(jìn)樣分析。計算棄去不同體積的濾液的峰面積與離心后峰面積的比值，考察該材質(zhì)的濾頭是否對3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮是否有吸附?？疾旖Y(jié)果見表2。

表2 濾膜吸附考察結(jié)果

棄去不同體積的濾液，3-氯甲基-1,2,4-三唑 啉-5-酮的峰面積與離心后峰面積的比值在98%～102%之間，表明該材質(zhì)的濾頭是對3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮無吸附，可以用于過濾本品供 試液。

2.5 線性與范圍

取對照品貯備液，用溶劑（0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定量稀釋制成相當(dāng)于限度（160 mg·L-1）濃度的20%、50%、80%、100%、150%與200%系列濃度的線性溶液，依次取各溶液20 μL進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以雜質(zhì)的峰面積為橫坐標(biāo)，做散點圖，并進(jìn)行線性擬合分析。線性方程為=2.942 3×10-2+1.838 8×10-3，線性相關(guān)系數(shù)為1.000 0，表明3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮在 32～320 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關(guān)系好。

2.6 LOQ與LOD

參考對照品溶液中主峰的信噪比，取對照品溶液適量，稀釋后進(jìn)樣分析，當(dāng)溶液中主峰的信噪比/≥10時，該溶液作為定量限（LOQ）溶液；再取定量限溶液稀釋后進(jìn)樣分析，按信噪比/≥3作檢測限（LOD）溶液。取定量限溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的定量限為 0.66 ng，檢測限為0.20 ng。定量限溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積小于10.0%，保留時間小于2.0%。該方法檢測靈敏度良好。

2.7 準(zhǔn)確度

取本品約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，精密加入雜質(zhì)貯備液1 mL（限度濃度的50%）或2 mL（限度濃度）或3 mL（限度濃度的150%），再用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。每個限度濃度各平行配制3份。按外標(biāo)法以峰面積計算回收率。3-氯甲 基-1,2,4-三唑啉-5-酮在3個濃度點的回收率在99.3%～101.1%之間，（=9）小于5.0%，回收率及回收率的值均符合要求。

2.8 重復(fù)性

照準(zhǔn)確度項下配制6份限度濃度的加標(biāo)供試液，各取20 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算加標(biāo)供試液中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的含量，均值為0.017%，為3.3%。該方法重復(fù)性符合驗證要求。

2.9 中間精密度

不同的實驗人員于不同日期，使用不同的儀器，重新配制6份加標(biāo)供試液，測定加標(biāo)供試液中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的含量。此次測定的6次結(jié)果與重復(fù)性6次結(jié)果共12次，測量結(jié)果的均值為0.016%，為4.5%。該方法中間精密度符合驗證要求。

2.10 進(jìn)樣精密度

取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮峰面積的為0.6%，保留時間為0.1%，表明儀器的進(jìn)樣精密度符合要求。

2.11 溶液穩(wěn)定性

取對照品溶液和供試液，在室溫條件下放置0、2、6、12、18 h后，分別進(jìn)樣。對照品溶液在室溫放置18 h，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮峰面積與0 h峰面積的比值在90%～110%之間；供試液中未檢出該雜質(zhì)，且無其他雜質(zhì)峰干擾。對照品溶液和供試液至少在室溫18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.12 耐用性

適當(dāng)調(diào)整流速、柱溫、磷酸濃度等參數(shù)，對照品溶液中，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮峰理論板數(shù)均大于5 000，拖尾因子在0.8～1.2范圍內(nèi)；供試液中均未檢出該雜質(zhì)；加樣供試液中該雜質(zhì)的含量相差不大。該方法耐用性良好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的最大吸收為215.9 nm，故采用210 nm波長作為檢測波長。

3.2 供試液濃度的確定

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮質(zhì)量濃度為 0.16 μg·mL-1時響應(yīng)值的/約為112，以此作為限度質(zhì)量濃度，則供試液質(zhì)量濃度為1.023 mg·mL-1。最終確定供試品質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。

3.3 供試液配制方法的選擇

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮為強極性化合物，為避免其在反相色譜系統(tǒng)中分析時產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，選用的溶劑應(yīng)含有高比例的水相（0.1%磷酸-甲醇（95∶5）），而阿瑞匹坦為弱極性化合物，在水中幾乎不溶。因此溶劑0.1%磷酸-甲醇（95∶5）不能使阿瑞匹坦溶解成1 mg·mL-1的溶液，3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮在甲醇和水中溶解度良好。故先使用盡可能少的甲醇使供試品和其中可能存在的3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮溶解，再使用0.1%磷酸稀釋定容至刻度，供試品析出，而可能存在的3-氯甲基-1, 2,4-三唑啉-5-酮依然在溶液中，過濾，取續(xù)濾液作為供試液。

4 結(jié) 論

本研究對3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的檢測方法進(jìn)行了詳細(xì)方法學(xué)驗證，該方法專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性良好，可用于阿瑞匹坦中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的檢測，為合格的阿瑞匹坦的生產(chǎn)提供了有效的質(zhì)控方法。

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Determination of Genotoxic Impurity 3-Chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one in Aprepitant by HPLC

,,,

（Nanjing ChiaTai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing Jiangsu 210046, China）

A HPLC method for the determination of 3-chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one, a genotoxic impurity of aprepitant was established. Agilent poroshell 120 series EC-C18 column was used as chromatographic column.Linear gradient elution was carried out with 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B.The flow rate was 1.0mL·min-1.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 210nm. The results showed that the solvent and the main peak did not interfere with the determination of the impurity.The linearity of the impurity was good in the range of 20%～200% of the limit concentration.The recovery of this impurity was in the range of 99.3% ～ 101.0%, and thewas less than 5.0%.The solution were stable within 18h at room temperature.Thes of repeatability and precision were less than 5.0%. This method has good specificity, precision and accuracy, and can be used for the detection of genotoxic impurity 3-chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one in this product.

Aprepitant; Genotoxic impurity; 3-Chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one; Liquid chromatography (HPLC)

TQ460.7

A

1004-0935（2023）09-1399-04

2022-09-12

常月賞（1993-），女，河北省衡水市人，碩士，2019年畢業(yè)于中國藥科大學(xué)藥物化學(xué)專業(yè)，研究方向：藥物分析。

蘭公劍（1981-），男，工程師，碩士，研究方向：藥物分析。