李 麗，紀(jì) 寧，阮 迪，李丹丹

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院推拿科，烏魯木齊 830099）

乳腺增生癥（mammary gland hyperplasia, MGH）是由于雌激素分泌失調(diào)導(dǎo)致的乳腺慢性良性增生疾病，以一側(cè)或兩側(cè)乳房腫塊、周期性脹痛為主要臨床表現(xiàn)[1]。乳腺增生是中青年女性的常見病，其發(fā)病率占全部乳房疾病的75%，且存在一定的癌變率，嚴(yán)重影響患者的身心健康[2]。目前乳腺增生的治療主要以口服激素類藥物緩解臨床癥狀，或手術(shù)治療為主，但都存在遠(yuǎn)期療效差，治療后易復(fù)發(fā)的問題。推拿治療安全有效且價(jià)格低廉，在乳腺增生的非手術(shù)治療中具有很大優(yōu)勢(shì)[3]。但其作用機(jī)制尚不明確，影響了臨床的推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用外源性激素注射法制備乳腺增生大鼠模型，通過觀察循經(jīng)通絡(luò)推拿手法及臨床常用藥三苯氧胺對(duì)乳腺增生大鼠乳頭直徑、乳頭高度，乳腺組織形態(tài)，E2（雌二醇）、P（孕激素）及其受體的影響，對(duì)比推拿手法治療、藥物治療與手法聯(lián)合藥物的治療效果，并探討其治療乳腺增生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)SD 雌性大鼠50 只，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量180 ～220 g，飼養(yǎng)溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度40%～70%，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組（對(duì)照組、模型組、手法組、藥物組、藥物加手法組），每組10 只。

1.2 主要試劑 苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液購(gòu)自北京索萊寶有限責(zé)任公司，三苯氧胺購(gòu)自上海華聯(lián)制藥有限公司，蘇木素染液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，伊紅染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，大鼠雌二醇（E2）、大鼠孕激素（PROG）ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，抗雌激素受體α（ERα）、抗孕激素受體（PR）一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 TGL-16GB 型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海飛鴿儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），光學(xué)顯微鏡（日本尼康），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能），DYCZ-24DN 型電泳儀（北京六一），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.4 造模方法 除對(duì)照組外，模型組、手法組、藥物組和藥物加手法組均采用肌肉注射雌二醇和黃體酮法制備大鼠乳腺增生模型[4]：大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mL/kg），每日1 次，持續(xù)25 d，第26天起肌肉注射黃體酮注射液（5 mg/kg），每日1 次，連續(xù)5 d。造模結(jié)束后觀察各組大鼠乳頭外觀形態(tài)，測(cè)量大鼠乳頭直徑，并取乳腺組織行HE 染色觀察病理變化。以大鼠乳頭紅腫豎起高于皮膚表面，乳頭直徑增大，病理染色見乳腺小葉增多、導(dǎo)管及腺泡增生等形態(tài)為造模成功。

1.5 治療方法 手法組于造模同時(shí)予以循經(jīng)通絡(luò)推拿手法治療，將大鼠固定于固定板，使用電動(dòng)剃毛器充分剃毛后涂抹適量刮痧油，參照“大鼠穴位圖譜”操作，具體步驟如下：1）指腹直推手三陰經(jīng)（前肢內(nèi)側(cè)至腋窩處），并延乳房外圍向乳頭方向指揉乳絡(luò)；2）指腹直推足三陰經(jīng)（后肢內(nèi)側(cè)根部至后掌足跖）；3）指腹直推任脈（頸部至恥骨）、督脈（頸部至尾根部）；4）指尖推揉乳房部；直推、按揉力度適中、速度均勻、順逆經(jīng)交替，至局部皮膚發(fā)紅發(fā)熱。每次治療10 min，每日1 次，持續(xù) 30 d。藥物組在造模同時(shí)給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）每日灌胃治療，持續(xù)30 d。藥物加手法組在給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）灌胃的同時(shí)予以循經(jīng)通絡(luò)推拿手法治療，每日1 次，持續(xù) 30 d。對(duì)照組與模型組大鼠不予干預(yù)。

2 檢測(cè)指標(biāo)

2.1 一般狀態(tài)觀察 治療結(jié)束后，測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量，同時(shí)觀察大鼠精神狀態(tài)、被毛情況和活動(dòng)狀況。

2.2 大鼠乳頭直徑與高度測(cè)量 治療結(jié)束后，用精密游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠第2 對(duì)左右乳頭直徑和乳頭高度，比較模型組與對(duì)照組，各治療組與模型組大鼠乳頭直徑、乳頭高度的差別。

2.3 HE 染色觀察大鼠乳腺組織病理形態(tài)變化 治療結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血并處死，解剖后取右側(cè)第2 對(duì)乳房，取乳腺組織于4 %多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)作 5 μm 切片，再經(jīng)脫蠟至水、蘇木素-伊紅（HE）染色、70%鹽酸乙醇分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡觀察乳腺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.4 ELISA 檢測(cè)大鼠血清中E2、P 含量變化 治療結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心10 min 取血清，置于-20 ℃冰箱保存。血清常溫下放置1 h，3 000 r/min離心15 min 后檢測(cè)：樣品孔加入待檢樣品10 μL，樣品稀釋劑加入40 μL，加入抗體100 μL，置于37 ℃孵育1 h 后洗板5 次。各反應(yīng)孔加入底物液A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，隨后加入終止液50 μL，于酶標(biāo)儀450 nm 下檢測(cè)OD 值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本E2、P 含量。

2.5 Western-blot 檢測(cè)大鼠乳腺組織中ERα、PR 的蛋白表達(dá) 取各組大鼠部分乳腺組織置于裂解液中，勻漿器于冰上勻漿，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min 離心 20 min提取組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。制膠后取10 μL 蛋白樣品上樣，電泳分離，冰上轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，滴加ECL 發(fā)光液，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光并拍照，用Image J 軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的灰度值比值，分析相對(duì)蛋白含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠飲食飲水正常；大小便正常，大便成形，未見稀便，小便顏色正常。各組大鼠皮膚完整無(wú)潰爛，毛發(fā)光澤柔順；精神活躍、捕捉抵抗適中。模型組大鼠經(jīng)造模后，乳頭直徑和高度與對(duì)照組相比明顯增大，經(jīng)評(píng)估造模成功。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。

3.2 大鼠乳頭直徑、乳頭高度及體質(zhì)量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠兩側(cè)乳頭高度、直徑明顯增大，大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；各治療組大鼠經(jīng)治療后，乳頭高度和直徑較模型組顯著減?。≒＜0.05），大鼠體質(zhì)量與模型組相比無(wú)明顯差異（P> 0.05）；藥物組大鼠乳頭直徑、藥物加手法組乳頭高度和直徑與手法組相比改善更為明顯（P＜0.05）；藥物加手法組大鼠左側(cè)乳頭直徑較藥物組改善更為明顯（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠乳頭直徑、乳頭高度及體質(zhì)量 （± s，n = 10）

表1 各組大鼠乳頭直徑、乳頭高度及體質(zhì)量 （± s，n = 10）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05；與藥物組比較，□P ＜0.05

組別 左側(cè)乳頭高度/mm 左側(cè)乳頭直徑/mm 右側(cè)乳頭高度/mm 右側(cè)乳頭直徑/mm 體質(zhì)量/g對(duì)照組 1.376±0.222 0.767±0.080 1.381±0.235 0.766±0.056 242.410±21.105模型組 2.121±0.281# 1.185±0.103# 2.162±0.312# 1.155±0.126# 219.320±21.720#手法組 1.648±0.282#△ 0.905±0.107#△ 1.626±0.277△ 0.920±0.137△ 234.340±17.652藥物組 1.515±0.303△ 0.776±0.101△▲ 1.534±0.258△ 0.722±0.064△▲ 234.090±21.818藥物加手法組 1.345±0.307△▲ 0.649±0.103△▲□ 1.374±0.297△▲ 0.668±0.079△▲ 227.280±17.677

3.3 大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 HE 染色結(jié)果可見，對(duì)照組大鼠乳腺組織中乳腺小葉未見明顯增生，腺泡較少，導(dǎo)管未見明顯擴(kuò)張，個(gè)別導(dǎo)管內(nèi)可見少量分泌物；模型組大鼠乳腺組織中部分乳腺小葉增生，腺泡增大，部分導(dǎo)管腔擴(kuò)張，導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生，可見較多分泌物；與模型組比較，手法組和藥物組病變改善不明顯；藥物加手法組乳腺增生小葉減少，乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張減輕，導(dǎo)管內(nèi)分泌物減少，見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)（HE，×200）

3.4 大鼠血清中E2、P 含量比較 ELISA 結(jié)果可見，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中E2含量顯著升高（P＜0.05），P 的水平明顯降低（P＜0.05）；手法組大鼠血清中E2、P 的含量變化與模型組相比改善不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），藥物組和藥物加手法組大鼠血清中E2水平較模型組均明顯降低（P＜0.05），P 的含量明顯升高（P＜0.05）；藥物加手法組血清中E2、P 的含量變化與手法組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中E2、P 含量（± s，n = 10）

表2 各組大鼠血清中E2、P 含量（± s，n = 10）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

組別 E2/（pg/mL） P/（ng/mL）對(duì)照組 18.612±3.237 3.985±1.742模型組 29.334±1.933# 0.985±0.418#手法組 27.928±2.271# 1.189±0.679#藥物組 24.559±2.889#△ 1.913±0.710#△藥物加手法組 22.428±4.169△▲ 2.942±1.489△▲

3.5 大鼠乳腺組織中ERα、PR 的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠乳腺組織中ERα 的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），PR 的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；藥物加手法組較模型組顯著下調(diào)了ERα 的表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)了PR 的表達(dá)（P＜0.05），藥物組較模型組上調(diào)了PR 的表達(dá)（P＜0.05）；手法組與模型組比較，ERα、PR 的表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），藥物加手法組與手法組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 各組大鼠乳腺組織ERα、PR 的蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠乳腺組織ERα、PR 的蛋白表達(dá)（± s，n = 6）

表3 各組大鼠乳腺組織ERα、PR 的蛋白表達(dá)（± s，n = 6）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

組別 ERα PR對(duì)照組 0.436±0.041 0.824±0.039模型組 0.892±0.032# 0.403±0.050#手法組 0.813±0.054# 0.502±0.064#藥物組 0.725±0.061#△ 0.594±0.062#△藥物加手法組 0.569±0.045△▲ 0.718±0.036△▲

4 討論

乳腺增生癥（mammary gland hyperplasia, MGH）是以乳腺導(dǎo)管和小葉結(jié)構(gòu)紊亂，乳腺組織良性增生為主要表現(xiàn)的女性常見病[5]。近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏的加快，其發(fā)病率明顯升高，且呈年輕化趨勢(shì)發(fā)展?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)乳腺增生尚無(wú)理想治療方案，目前多采用激素類藥物及手術(shù)治療[6-7]。以三苯氧胺為主的抗雌激素藥物對(duì)乳腺增生具有較好的近期療效，但長(zhǎng)期應(yīng)用容易加重患者內(nèi)分泌紊亂，且停藥后易復(fù)發(fā)；手術(shù)療法亦存在術(shù)后易復(fù)發(fā)的問題，且治療費(fèi)用較高，患者多出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥[8]。中醫(yī)外治法不良反應(yīng)小，遠(yuǎn)期療效好，且價(jià)格低廉，在乳腺增生的非手術(shù)治療中具有很大優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)學(xué)將乳腺增生歸屬為“乳癖”范疇，認(rèn)為其病位在肝、脾、腎，發(fā)病機(jī)理以腎氣不足，沖任失調(diào)為本，肝脾郁結(jié)，氣滯、痰凝、血瘀凝滯為標(biāo)，治宜調(diào)節(jié)沖任，疏肝健脾，化痰散結(jié)，暢通經(jīng)絡(luò)[9]。循經(jīng)推拿手法是一種以經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)的外治手段，通過推揉按摩經(jīng)穴激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣機(jī)，起到疏通經(jīng)絡(luò)，行氣運(yùn)血的作用，在臨床應(yīng)用中對(duì)胸腹、腰背痛，泄瀉，便秘，月經(jīng)不調(diào)等癥均有顯著療效[10-11]。乳房被稱為“宗經(jīng)之所”，周圍經(jīng)絡(luò)縱橫，多條經(jīng)脈匯集于此[12]，其中足厥陰肝經(jīng)布于兩脅，環(huán)繞乳頭而行；足太陰脾經(jīng)絡(luò)胃，上膈，散布胸脅，行至乳頭之外；足少陰腎經(jīng)貫肝膈，其支脈入胸中，故循經(jīng)按摩以足三陰經(jīng)為主，所謂“經(jīng)脈所過，主治所及”[13]。沖任二脈同起于胞中，沖脈與足少陰經(jīng)并行向上而布于胸中，任脈行于兩乳之間，乳房的生理病理狀態(tài)直接受此二脈經(jīng)氣盈虧的調(diào)節(jié)；督脈行于背脊正中，為“陽(yáng)脈之?！?，任脈為“陰脈之?！保}通調(diào)則全身氣血通暢，百脈皆通[14]。此外，手三陰經(jīng)分布于上肢及腋窩，過胸部乳頭外側(cè)，肝有邪常客于兩腋，通過手法作用于此三脈亦可達(dá)到疏肝散結(jié)之效[15]。

本研究采用外源性激素注射法建立乳腺增生大鼠模型，應(yīng)用循經(jīng)通絡(luò)推拿手法作用于大鼠足三陰、手三陰經(jīng)、任脈、督脈和乳房部，在此基礎(chǔ)上結(jié)合常規(guī)西藥三苯氧胺治療，觀察單純手法、單純藥物及手法加藥物治療對(duì)乳腺增生大鼠的療效。乳腺增生大鼠表現(xiàn)為乳房和乳頭直徑增大，通過精密游標(biāo)卡尺測(cè)量乳頭高度和直徑可直觀反映大鼠乳腺增生程度[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各治療組大鼠乳頭直徑、乳頭高度較模型組均有顯著改善，其中手法加藥物組效果最佳，較手法組改善更為明顯，與藥物組無(wú)異。病理染色結(jié)果可見，藥物加手法組大鼠乳腺增生程度較模型組明顯減輕，而藥物組和手法組病變改善不明顯，提示手法推拿聯(lián)合藥物的治療效果優(yōu)于單純手法和單純藥物治療。乳腺增生的發(fā)病原因與E2、P 及其受體的水平變化密切相關(guān)[17-18]。E2是由卵巢所分泌的機(jī)體最重要的性激素，乳腺組織的正常發(fā)育及其功能受到E2的調(diào)控[19]。其與乳腺組織上的ER 結(jié)合，在正常分泌時(shí)促進(jìn)乳腺組織發(fā)育，而過量表達(dá)的E2則可通過雌激素受體α（ERα）的介導(dǎo)刺激乳腺上皮增生，使乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張，間質(zhì)纖維增生，導(dǎo)致乳腺增生發(fā)生[20-22]。血清中E2的含量常作為臨床判定乳腺增生治療效果的重要指標(biāo)[23-24]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清中E2含量顯著升高，藥物組和藥物加手法組大鼠E2含量均明顯降低，而手法組較模型組降低不明顯。同時(shí)Western-blot 結(jié)果顯示，模型組乳腺組織中 ERα 的蛋白表達(dá)明顯增加，藥物組、藥物加手法組顯著下調(diào)了ERα 表達(dá)，而手法組下調(diào)不明顯。另一方面，P 與E2間存在著相互拮抗作用。P 與其受體PR相結(jié)合，在正常分泌狀態(tài)下促進(jìn)乳腺小葉的發(fā)育，P 含量的降低可進(jìn)一步促使E2的大量分泌，使乳腺增生加重[25-26]。模型組大鼠血清中P 的含量及乳腺組織中PR 的蛋白表達(dá)均顯著降低，經(jīng)治療后，藥物組和藥物加手法組均明顯上調(diào)了P 含量和PR 的蛋白表達(dá)，其中藥物加手法組效果最佳，而手法組較模型組上升不明顯。同樣說(shuō)明了循經(jīng)通絡(luò)推拿聯(lián)合藥物的治療方法優(yōu)于單純手法和單純西藥治療，能夠調(diào)節(jié)乳腺增生大鼠體內(nèi)激素水平來(lái)達(dá)到治療目的。

循經(jīng)通絡(luò)推拿療法作用于乳腺增生患者療效明顯，通過前期研究發(fā)現(xiàn)，其臨床治愈率為80%，總有效率達(dá)100%[27]。本實(shí)驗(yàn)中單純應(yīng)用推拿手法治療雖能一定程度地改善乳腺增生大鼠病變程度，但在病理和分子水平上未見明顯作用，而當(dāng)手法結(jié)合藥物治療時(shí)發(fā)揮了協(xié)同作用，對(duì)乳腺增生的改善效果最佳。其原因可能與推拿療法顯效較慢，需長(zhǎng)期堅(jiān)持相關(guān)。三苯氧胺用于乳腺增生療效顯著，但存在停藥后易于復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)，而推拿療法的遠(yuǎn)期療效普遍優(yōu)于西藥治療，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示循經(jīng)推拿配合三苯氧胺內(nèi)外結(jié)合治療，其效果與單純應(yīng)用三苯氧胺、單純推拿治療相比更為明顯，為中西醫(yī)結(jié)合干預(yù)治療乳腺增生提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。