彭彩亮，崔 璇，蔣 寧，馬熙凱，郭夢雨，王超龍，陳 曦，王首舜

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院，哈爾濱 150040）

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）仍然是全球死亡率最高的疾病之一。心肌缺血后血流再恢復可以緩解缺血癥狀，但可能會加重由心肌缺血/再灌注損傷（MI/RI）引起的心肌損傷。心肌缺血/再灌注損傷過程中的氧化應激、炎癥反應等機制引起嚴重的心臟疾病如心臟功能障礙、心律失常，此外，還可引起心肌細胞壞死[1-2]。自噬是細胞對多種應激的保護機制之一，在心肌缺血/再灌注損傷過程中起重要作用，被認為是新的調(diào)控靶標[3-4]。Nrf2 信號通路可通過誘導細胞保護基因來保護細胞免受氧化應激。研究表明，Nrf2 信號通路與心肌缺血再灌注有關[5]。老鸛草素是老鸛草中的一種具有顯著抗氧化活性的多酚化合物，具有抗高血壓、抗氧化等作用[6-8]。本研究通過實施體內(nèi)外實驗，探討老鸛草素對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠75 只，8 周齡，體質(zhì)量（24±2）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。本研究通過動物倫理委員會批準（hljzy202001201）。H9C2 細胞購自中國科學院細胞庫。老鸛草素購自美國Sigma 公司（20200816）；CK-Mb、Mb、cTnI 檢測試劑盒，購自基蛋生物科技有限公司（20210205）；抗體β-actin、LC3II、LC3I、Beclin1、P62、Nrf2、 HO-1 均購自美國Cell Signaling Technology 公 司（20210318，20210219，20200115，20200402，20200317，20200425，20200502）。BCA 試劑盒購自碧云天生物技術公司（20210327）。 Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；BL-420F型生物信號采集系統(tǒng)（成都泰盟）；OlymPus CX31 正置顯微鏡（日本OlymPus 公司）； 2135 型組織切片機（德國徠卡公司）。

1.2 給藥和建模 將75 只SPF 級雄性小鼠用隨機數(shù)字表分為低劑量組（5 μmol/L）、中劑量組（10 μmol/L）、高劑量組（20 μmol/L）、假手術組和模型組，各15 只。根據(jù)文獻方法[12]結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備心肌缺血/再灌注損傷模型（缺血30 min，再灌注2 h，以心電圖 QRS 波加大和 ST 抬高作為建模成功的標準）和心肌缺血/再灌注損傷加不同劑量老鸛草素組 ，假手術組小鼠除不結(jié)扎外其他處理相同；老鸛草素處理組小鼠腹腔注射給藥；假手術組和模型組給予等量生理鹽水；每日1 次，連續(xù)7 d。末次給藥后小鼠禁食、麻醉后連接心電圖。氣管造口完成后，連接呼吸機。結(jié)扎小鼠的左冠狀動脈30 min，然后再灌注120 min。

1.3 心功能檢測 再灌注2 h 后，超聲心動圖檢查各組小鼠的左心室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、左心室壁厚度（LVWT）、心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）水平。

1.4 檢測心功能標志物 心功能監(jiān)測結(jié)束后，各組各取10 只小鼠，取5 mL 股動脈血，3 000 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液于-80 ℃儲存，檢測Mb、CK-Mb、cTnI 水平，采用ELISA 法嚴格按照試劑說明書操作，重復3 次。

1.5 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌病理變化 心功能損傷標志物檢測結(jié)束后，處死小鼠，將50 只小鼠開胸取出心臟，濾紙吸干水分和血跡，沿房室溝剪去左右心房、主動脈和肺動脈、右心室，留取左心室，從左心室中部橫軸切下部分心肌組織（厚度約0.5 cm）于4%多聚甲醛中固定72 h。經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后進行HE 染色，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠片封片后置于顯微鏡下觀察心肌病理變化。

1.6 細胞處理方法 H9C2 細胞購自中國科學院細胞庫。按照標準細胞操作流程，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，即為對照組，模擬缺血/再灌注（SI/R）組的細胞用含有酚紅的Hanks 液，置于低氧（1%O2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后，更換成正常培養(yǎng)液，在普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。老鸛草素治療（老鸛草素加 SI/R）組在模擬缺血/再灌注處理前30 min 用老鸛草素（終濃度為100 nmol/L[9]）處理細胞。自噬抑制劑3-MA 預處理組（3-MA 加老鸛草素加SI/R）在模擬缺血/再灌注處理前1 h 用3-MA（終濃度為5 μmol/L[10]）處理細胞。老鸛草素處理（Nrf2 SiRNA 加老鸛草素加 SI/R）組在模擬缺血/再灌注處理前48 h 用濃度為5 μmol/L 腺病毒SiRNA[11]轉(zhuǎn)染細胞沉默Nrf2，模擬缺血/再灌注處理前30 min 用老鸛草素（終濃度為100 nmol/L）處理細胞。

1.7 Western blot 檢測 從H9C2 細胞中提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測量濃度。電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂乳封閉后，將聚偏二氟乙烯膜與下列抗體在4 ℃ 孵育過夜：兔抗P62（Abcam，中國；1:500）、兔抗LC3I（Abcam，中國；1:500）、兔抗 LC3II Beclin1（Abcam，中國；1:500）、兔抗Nrf2（Abcam，中國；1:500）、兔抗 HO-1（Abcam，中國；1:500）、β-actin 一抗（Abcam，中國；1:500），Tris 緩沖鹽水沖洗后，將這些膜與HRP 標記過的IgG二抗（1:500）繼續(xù)孵育1 h。ECL 試劑顯示條帶。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件進行。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 老鸛草素對各組小鼠左心功能的影響 見表1。

表1 各組小鼠心臟功能指標水平比較（± s，n = 10）

表1 各組小鼠心臟功能指標水平比較（± s，n = 10）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與老鸛草素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與老鸛草素中劑量組比較，□P ＜0.05

組別 HR/（beat/min） LVSP/（mm Hg） LVEF/% FS/% LVWT/min假手術組 406.42±31.89 133.24±13.61 59.11±6.58 27.62±4.12 0.90±0.05模型組 201.12±29.88# 59.01±12.15# 23.31±7.25# 8.12±2.52# 0.56±0.06#老鸛草素低劑量組 225.36±26.35△ 76.45±11.82△ 28.34±7.22△ 10.12±2.1△ 0.63±0.04△老鸛草素中劑量組 295.16±30.05▲ 98.12±11.72▲ 39.67±8.11▲ 16.54±3.0▲ 0.75±0.08▲老鸛草素高劑量組 305.16±21.25□ 112.34±8.92□ 43.56±9.61□ 19.54±2.6□ 0.82±0.03□

2.2 老鸛草素對各組小鼠血清CK-Mb、Mb、cTnI 的影響 見表2。

表2 各組小鼠CK-Mb、Mb、cTnI 含量比較（± s，n = 10）

表2 各組小鼠CK-Mb、Mb、cTnI 含量比較（± s，n = 10）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與老鸛草素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與老鸛草素中劑量組比較，□P ＜0.05

組別 CK-Mb/（U/L） Mb/（U/L） cTnI/（ng/L）假手術組 22.32±5.87 26.89±8.64 0.10±0.08模型組 106.89±9.78# 150.52±10.26# 0.82±0.05#老鸛草素低劑量組 86.43±7.65△ 132.34±8.23△ 0.52±0.02△老鸛草素中劑量組 70.53±8.72▲ 85.34±8.96▲ 0.32±0.06▲老鸛草素高劑量組 50.23±6.92□ 65.67±7.26□ 0.22±0.04□

2.3 老鸛草素對各組小鼠心肌病理變化的影響 光鏡下可見，假手術組心肌結(jié)構(gòu)整齊，心肌間質(zhì)未見炎性細胞浸潤，心肌細胞無腫脹。模型組小鼠心肌細胞腫脹，心肌結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細胞浸潤心肌間質(zhì)。老鸛草素低劑量組心肌結(jié)構(gòu)部分整齊，炎性細胞浸潤部分減輕，心肌細胞腫脹部分減輕。老鸛草素中劑量組心肌結(jié)構(gòu)較整齊，炎性細胞浸潤明顯減輕，心肌細胞腫脹明顯減輕。老鸛草素高劑量組心肌結(jié)構(gòu)整齊，炎性細胞少許浸潤，心肌細胞無腫脹。如圖1。

2.4 老鸛草素對心肌缺血/再灌注損傷小鼠心肌組織中的自噬相關蛋白的影響 與假手術組相比，模型組LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 升高，P62 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，老鸛草素低，中，高劑量組P62 水平升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性升高。與模型組相比，老鸛草素低，中，高劑量組LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性降低。見圖2。

圖2 老鸛草素對心肌缺血/再灌注損傷小鼠心肌組織中的自噬相關蛋白的影響

2.5 老鸛草素對心肌缺血/再灌注損傷小鼠心肌組織中的Nrf2 信號通路的影響 與假手術組比較，模型組Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，老鸛草素低，中，高劑量組Nrf2、 HO-1 蛋白水平均升高（P＜0.05）。并呈現(xiàn)劑量依賴性升高。見圖3。

圖3 老鸛草素對心肌缺血/再灌注損傷小鼠心肌組織中的Nrf2信號通路的影響

2.6 老鸛草素對缺氧/復氧誘導損傷中H9C2 細胞的自噬相關蛋白的影響 與對照組比較，H9C2 細胞SI/R損傷后LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1升高，P62降低（P＜0.05）；與SI/R 組比較，老鸛草素加 SI/R 組LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低、P62 升高（P＜0.05）；與老鸛草素加SI/R 組比較，自噬抑制劑3-MA 預處理組LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1降低，P62升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 老鸛草素對缺氧/復氧誘導損傷中H9C2 細胞的自噬相關蛋白的影響

2.7 老鸛草素對缺氧/復氧誘導損傷中H9C2 細胞的保護通過Nrf2 信號通路 與對照組比較，H9C2 細胞SI/R 損傷后Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）；而與SI/R 組比較，老鸛草素加 SI/R 組Nrf2、 HO-1 蛋白水平升高（P＜0.05）；與老鸛草素加 SI/R 組比較，Nrf2 SiRNA 加老鸛草素加SI/R 組Nrf2、 HO-1 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 老鸛草素對缺氧/復氧誘導損傷中H9C2 細胞的Nrf2信號通路的影響

3 討論

介入治療是快速恢復缺血性心臟病心肌缺血的重要治療方式之一，但仍有可能發(fā)生心肌缺血/再灌注損傷[13]。Mb、CK-Mb、cTnI 是心肌損傷的標志物[14]。本實驗結(jié)果顯示， 心肌缺血/再灌注損傷小鼠的LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低（P＜0.05），血清Mb、CK-Mb、cTnI 水平升高；心肌細胞腫脹，心肌間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，而在心肌缺血/再灌注損傷建模之前予以不同濃度老鸛草素處理可以逐漸顯著改善以上情況。本研究結(jié)果首次揭示老鸛草素對小鼠心肌缺血/再灌注損傷具有改善作用。

自噬是細胞自動降解自身受損的細胞器和蛋白質(zhì)的過程[15]。在持續(xù)缺血缺氧或再灌注狀態(tài)下，自噬表達過度增強，不利于細胞存活[16]。微管相關蛋白3（LC3）被認為是自噬標志分子[17]。Beclin-1 是自噬的正調(diào)節(jié)因子[18]。P62 蛋白與LC3 相互作用，其蛋白水平與自噬水平成反比[19-20]。本結(jié)果提示老鸛草素通過調(diào)控自噬抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷。

研究報道Nrf2 信號通路參與自噬的調(diào)節(jié)[21]。機體在外界有害刺激下， 導致Nrf2 活化并進入細胞核，啟動抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達[22]。HO-1 是Nrf2 信號通路中的關鍵靶蛋白[23]。本研究結(jié)果提示，老鸛草素通過Nrf2 信號通路減輕心肌缺血/再灌注損傷小鼠心肌損傷。

綜上所述，老鸛草素可能通過激活Nrf2 信號通路，抑制心肌細胞過度自噬，對心肌缺血再灌注損傷起到明顯保護作用，這是老鸛草素藥理作用的新發(fā)現(xiàn)，為臨床防治心肌缺血/再灌注損傷提供新的方法。