趙培文，付生娣

（保山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 保山 678000）

1 TEPP 基因研究

1.1 研究背景

生豬作為畜牧業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，是保障人們?nèi)忸愂称返闹饕獊碓?。隨著科學(xué)選育的推進，在生長速度、飼料報酬和瘦肉率方面的選育進展很快，而在繁殖性狀方面進展很慢[1]。根據(jù)平均飼養(yǎng)水平，母豬每胎產(chǎn)仔數(shù)提高1頭，最低可增收100元左右，在遺傳上改良繁殖性狀有利于提高經(jīng)濟價值，因而提高豬的繁殖力愈來愈受到重視[2]。目前多采用數(shù)量遺傳學(xué)方法，通過選擇和雜交從遺傳上達到改良群體的目的。豬產(chǎn)仔數(shù)遺傳力低，常規(guī)育種對產(chǎn)仔數(shù)性狀的改變非常有限，所以尋找控制豬繁殖率的主效基因及其遺傳標記對提高豬產(chǎn)仔數(shù)具有重要意義[3]。借助分子標記改變繁殖性狀，從而加速遺傳研究進展。只要能發(fā)現(xiàn)影響重要繁殖性狀候選基因的分子標記，便可通過輔助育種有效提高豬繁殖能力。

1.2 TEPP基因研究進展

TEPP是表達動物生殖器官如睪丸、前列腺、胎盤的一種基因，在睪丸中表達水平最高，可能對動物生殖過程起著重要的作用[4]。由于TEPP基因在動物體內(nèi)的表達特性，推斷可能對動物生殖過程有重要作用，可作為繁殖相關(guān)候選基因進行研究。

1.3 撒壩豬

是云南省的地方特色優(yōu)良品種，是云南省保護及開發(fā)利用較為系統(tǒng)、完整的地方豬種資源之一。撒壩豬分布面較廣、養(yǎng)殖數(shù)量多、環(huán)境適應(yīng)性強，而且肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖性能好，是生產(chǎn)雜種商品肉豬的優(yōu)良母本[5]。撒壩豬按體型大小、頭式、外貌特征及成熟早晚等分為大、中、小3種類群，其中大型稱為“八卦頭”，小型稱為“狗頭”或“油葫蘆”豬，中型稱為“羊頭”或“二虎頭”，被毛大多以黑毛為主，也有火毛等。經(jīng)過純繁選育的新品系撒壩豬，初產(chǎn)達8.72頭，經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)11.84頭，7對乳頭的仔豬占總產(chǎn)仔數(shù)的37.2%。

本實驗?zāi)康脑谟诶矛F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究撒壩豬TEPP基因SNP位點，統(tǒng)計其在撒壩豬群中的等位基因頻率和基因型頻率，并分析SNP位點多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系，為提高豬繁殖性能提供理論基礎(chǔ)，以期為豬遺傳育種提供指導(dǎo)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗豬耳尖部分經(jīng)乙醇消毒后夾取小塊耳組織，分別放入已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，加入75%乙醇，置于-20 ℃環(huán)境儲存?zhèn)溆?。記錄實驗撒壩母豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)等指標數(shù)據(jù)（見表1）。

表1 樣本數(shù)量和來源表

2.2 實驗方法

2.2.1 常規(guī)酚-氯仿抽提法提取DNA

①取約10 mg耳組織置于1.5 mL的離心管中，用眼科手術(shù)剪剪碎，置于37 ℃恒溫烘箱中待乙醇揮發(fā)30 min→ ②向耳組織樣品中加入650 μL的DNA組織提取液和25 μL蛋白酶K（10 mg/mL）溶液，顛倒混勻后置于55～56 ℃的水浴鍋中消化6～9 h（最好放置過夜）。最初1 h輕輕顛倒幾次，待消化好時，可見離心管內(nèi)的液體清亮、均勻，且不見組織塊狀物→ ③向消化好的組織樣中加入等體積的Tris飽和酚，輕輕混勻10 min，用高速臺式離心機（12 000 r/min，以下同）離心10 min，吸取上清液600 μL置于另一干凈的1.5 mL離心管內(nèi)，注意盡量避免吸取白膜樣物質(zhì)→ ④向吸取的上清液中加入等體積的25∶24∶1的酚∶氯仿∶異戊醇，輕輕混勻10 min，離心10 min，吸取上清液約500 μL置于另一干凈的1.5 mL 離心管內(nèi)→ ⑤向吸取的上清液中加入等體積（500 μL）的24∶1的氯仿∶異戊醇，輕輕混勻10 min，心10 min，吸取上清液約400 μL。重復(fù)該步驟1次→ ⑥向吸取的上清液中加入2倍體積（600～700 μL）的無水乙醇，輕輕顛倒幾次，可見白色DNA團出現(xiàn)，在-20 ℃環(huán)境下靜置4 h以上。再離心1～2 min后，小心倒掉無水乙醇，保留DNA團→ ⑦加入70%的乙醇1 000 μL清洗DNA團2次，輕輕顛倒幾次，小心倒去乙醇，清洗完畢倒置離心管，自然恢復(fù)2 h→ ⑧加入TE緩沖液約100 μL溶解DNA團，37℃助溶過夜，68 ℃水浴15～30 min滅活后，瞬時離心，于-20 ℃長期貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 全基因組DNA的檢測過程

① 制備1%瓊脂糖凝膠→ ② 吸取2 μL的DNA原液，與3 μL雙蒸水混合稀釋，加入1 μL上樣緩沖液。80 V穩(wěn)壓電泳20 min→ ③電泳完畢，置于紫外透射儀下觀測DNA亮度及是否存在降解情況→ ④將DNA原液稀釋1 000倍，加入比色皿中，置于檢測孔→ ⑤檢測DNA樣品的值及濃度，并換算為原液濃度→ ⑥依原液濃度酌量加入TE稀釋至50 ng/μL，標明記錄→ ⑦DNA原液于-20 ℃環(huán)境長期凍藏，稀釋液可儲存于4 ℃環(huán)境下待用。

2.2.3 PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)的反應(yīng)體系及條件

（1）PCR引物的設(shè)計與合成。利用GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載豬TEPP基因序列；利用Primer Premier 5.0 和 Oligo 7.0 軟件為豬TEPP基因SNP位點設(shè)計引物；引物序列為F：5-CGGGTCCCTGACTCCCTT-3和R：5-GTAGACCGACCCCTCTTG-3；目的片段長度為214 bp。

（2）PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系，PCR擴增采用2×Taq PCR MasterMix 試劑，25 μL反應(yīng)體系（見表2）。PCR反應(yīng)條件（見表3）。

表2 PCR反應(yīng)體系表

表3 PCR反應(yīng)條件表

（3）PCR產(chǎn)物的檢測。制備2%瓊脂糖凝膠，取10 μL的PCR產(chǎn)物上樣，其中一孔點入5 μL的DNAmarker2000作為對照。穩(wěn)壓120 V電泳40 min，待目的條帶完全分開，于凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并記錄。

（4）PCR產(chǎn)物的回收純化。①實驗前準備，在Buffer W2中加入指定體積的無水乙醇，準備高壓滅菌的Tips頭、離心管，水浴鍋水溫調(diào)節(jié)至70 ℃，待其升溫→ ②在紫外燈下迅速切取含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體。將含有目的片段的凝膠切碎后裝入已稱重的1.5 mL離心管中，再稱量。按照1 mg = 1 μL體積進行換算→ ③加入3個凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于70 ℃加熱，期間間斷混合，直至凝膠塊完全熔化為止→④加入0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻→ ⑤吸取步驟③中的混合液，將其轉(zhuǎn)移至含有吸附柱的制備管中，離心1 min，棄濾液→ ⑥將制備管置回離心管中，加入500 μL的Buffer W1，再離心1 min，棄濾液→ ⑦將制備管置回離心管中，加入700 μL的 Buffer W2，再離心1 min，棄濾液。重復(fù)該步驟→ ⑧將制備管置回離心管中，再離心1 min→ ⑨將制備管置于1.5 mL離心管中，在DNA制備膜中央加入Eluent 30 μL，室溫靜置1 min，再離心1 min洗脫DNA→ ⑩將回收純化的目的片段存放于-20℃環(huán)境下備用。

2.2.4 酶切反應(yīng)的反應(yīng)條件

酶切反應(yīng)體系為15 μL，其中8 μL的為PCR擴增膠回收產(chǎn)物，酶切反應(yīng)Buffer終濃度為1.5×，HpaⅡ內(nèi)切酶終濃度為5 U，加dd H2O補足至15 μL，37 ℃恒溫水浴4 h。

2.2.5 酶切反應(yīng)的檢測

制備3%瓊脂糖凝膠，待冷卻凝固后小心放入電泳槽中，電泳緩沖液（TAE）沒過膠面1 mm深，預(yù)電泳20～30 min，使瓊脂糖凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，上樣量10 μL，同時一孔加入 DNA Marker（DL 2000）作為分子量對照。120 V電泳使樣品跑出點樣孔，之后50～60 V下電泳3～4 h至條帶完全分開。在紫外燈下觀察結(jié)果，并在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相保存。

2.2.6 TEPP基因型命名

TEPP基因PCR擴增后所有實驗樣品均只有1條214 bp的條帶，經(jīng)HpaⅡ內(nèi)切酶酶切后，呈現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)酶切條帶差異可將其分為3種基因型：若只出現(xiàn)214 bp單條帶即可判定為AA基因型；若出現(xiàn)214 bp、168 bp和46 bp條帶可判定為AB基因型；若出現(xiàn)168 bp和46 bp條帶可判定為BB基因型。

2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

（1）基因頻率和基因型頻率的計算?；蝾l率是指一個群體中某一基因與其等位基因的相對比率。PA為A等位基因的頻率，PB為B等位基因的頻率，AA為AA基因型個體數(shù)，AB為AB基因型個體數(shù)，N為總?cè)后w數(shù)其計算如下：

PA= （2×AA+AB）/（2×N）；PB=1－PA；

基因型頻率=基因型個體數(shù)/N

（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計模型。根據(jù)影響豬繁殖性能的因素，用SAS（9.0版本）的GLM過程，配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較各個豬種的總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）、產(chǎn)活仔數(shù)（NBA）和在各基因型之間的差異：

Y = 均數(shù)+基因型效應(yīng)+胎次效應(yīng)+季節(jié)效應(yīng)+殘差效應(yīng)

3 結(jié)果與分析

3.1 全基因組DNA提取結(jié)果（圖1）

圖1 部分撒壩豬耳組織DNA凝膠電泳圖

從實驗豬耳組織中提取的DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰明亮，沒有拖帶，整齊，符合PCR擴增實驗要求。

3.2 基因多態(tài)性檢測結(jié)果

3.2.1 撒壩豬TEPP基因PCR擴增結(jié)果（圖2）

圖2 部分撒壩豬TEPP基因PCR擴增結(jié)果圖

TEPP基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，PCR擴增產(chǎn)物條帶大小為214 bp，條帶清晰、整齊、無雜帶，符合所要擴增的目的基因片段大小，可進行后續(xù)的酶切實驗。

3.2.2 撒壩豬TEPP基因PCR-RFLP反應(yīng)結(jié)果（圖3）

圖3 部分撒壩豬TEPP基因PCR-RFLP結(jié)果

TEPP基因PCR-RFLP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，呈現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)酶切條帶差異，可將其分為3種基因型，即只有214 bp條帶的是AA基因型，同時具有214 bp、168 bp和46 bp條帶的是AB基因型，有168 bp、46 bp條帶的是BB基因型。

3.3 TEPP基因頻率和等位基因頻率（表4）

表4 撒壩豬TEPP基因的基因型頻率和等位基因頻率表

對撒壩豬TEPP基因用HpaⅡ酶切檢測結(jié)果進行基因型頻率和基因頻率統(tǒng)計分析。AB為優(yōu)勢基因型，基因型頻率0.431，基因型頻率為AB＞AA＞BB。撒壩豬的優(yōu)勢等位基因為A，等位基因頻率為0.549。

3.4 TEPP基因不同基因型與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

3.4.1 基因型與初產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系（表5）

表5 撒壩豬不同基因型與初產(chǎn)仔數(shù)關(guān)系表

總產(chǎn)仔數(shù)中，BB型總產(chǎn)仔數(shù)最高，BB型＞AB型＞AA型，BB型比AB型和AA型分別多2.14頭和2.83頭，AA型和BB型差異極顯著，AB型與BB型差異顯著；產(chǎn)活仔數(shù)中，BB型產(chǎn)活仔數(shù)最高，BB型＞AB型＞AA型，BB型比AB型和AA型分別多1.66頭和1.83頭，AA型、AB型和BB型之間差異不顯著。

3.4.2 不同基因型與經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系（表6）

總產(chǎn)仔數(shù)為BB型＞AA型＞AB型，產(chǎn)活仔數(shù)為AA型＞BB型＞AB型，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的AA型、AB型和BB型3個基因型之間差異均不顯著。

4 討論與結(jié)論

4.1 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，撒壩豬的優(yōu)勢基因型為AB型，基因型頻率為0.431，撒壩豬優(yōu)勢等位基因為A，等位基因頻率為0.549。撒壩豬TEPP基因在初產(chǎn)母豬中高產(chǎn)基因型為BB型，其總產(chǎn)仔數(shù)趨勢為BB型＞AB型＞AA型，BB型比AA型和AB型多2.14頭和2.83頭，經(jīng)產(chǎn)母豬中沒表現(xiàn)出高產(chǎn)基因型。

4.2 討 論

通過對撒壩豬TEPP基因的優(yōu)勢基因型和優(yōu)勢等位基因的研究，對撒壩豬TEPP基因不同基因型與初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系的研究得出TEPP基因的SNP位點與豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)2個性狀存在相關(guān)性，但能否作為分子標記對豬多產(chǎn)性開展標記輔助選擇工作，有待進一步研究。