侯子航，羅 銳，朱文奇，季盈彤，時興銘，閆筱筱，崔 紅

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市鄭東新區(qū)平安大道218 號 450046

煙堿占煙草生物堿含量的90%～95%［1］，其在煙株中的作用主要是調(diào)節(jié)煙葉品質(zhì)和抵御害蟲侵食［2-3］。煙草植株表面覆蓋著大量表皮毛，其分泌物主要成分為西柏烷類二萜和蔗糖酯化合物，這些成分不僅是重要的香氣前體物質(zhì)，而且對蚜蟲具有明顯的趨避作用［4-6］。因此，提高煙葉煙堿含量及葉面化學成分含量對改善煙葉品質(zhì)和增強蚜蟲抗性具有重要意義。茉莉酸（Jasmonate acid，JA）是調(diào)控植物生長發(fā)育、應答多種脅迫反應的重要信號分子［7］，茉莉酸ZIM 結(jié)構域（Jasmonate zim domain，JAZ）蛋白是JA信號途徑中關鍵的轉(zhuǎn)錄抑制因子［8］，可以響應JA 的刺激，在SCFCOI1 復合物作用下被26S 蛋白酶體降解，釋放結(jié)合的MYC2 轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動JA 應答基因的轉(zhuǎn)錄［9-10］。在野生煙草中，JAZ沉默株系上調(diào)JA 響應基因，可增強對煙草天蛾的抗性［11］。擬南芥JAZ1基因在低溫條件下能激活植株的次生代謝，提高植株的耐寒性，維持植株正常的生長發(fā)育和物質(zhì)代謝［12-13］。Zhang 等［14-15］的研究表明，NtJAZ1基因可調(diào)控煙草中煙堿的生物合成，為通過敲除NtJAZ1基因來提高煙草中煙堿含量提供了可能。鄭淑心等［16］對K326 品種NtJAZ1基因進行編輯，發(fā)現(xiàn)NtJAZ1基因敲除后煙株煙堿含量顯著提高，但葉面腺毛密度及葉面化學成分含量有所降低。說明NtJAZ1的功能缺失可促進煙堿生物合成，同時對腺毛發(fā)生也有一定影響。Y2001 作為高分泌型突變品系，具有產(chǎn)量高、生育期短、易烘烤的特點，且長柄腺毛密度及分泌物含量也較高［17］，在豫中煙區(qū)頗受青睞。為進一步提高Y2001 的品質(zhì)和抗性，彰顯其濃香型風格特色，利用基因編輯技術對Y2001 中的煙堿負調(diào)控基因NtJAZ1進行敲除，研究了NtJAZ1敲除對煙株發(fā)育、煙堿生物合成、腺毛發(fā)育和腺毛分泌物積累以及蚜蟲抗性的影響，旨在為Y2001 品系的品質(zhì)改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為Y2001，幼苗培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為25 ℃、相對濕度60%，光暗交替，16 h光照、8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1NtJAZ1基因載體構建

根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站（https：//solgenomics.net/）已發(fā)表的煙草NtJAZ1基因序列Nitab4.5_0000073g0270.1（NtJAZ1a）、Nitab4.5_0004234g0080.1（NtJAZ1b），利用CRISPR2 在線軟件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）設計靶位點序列（Targeting Sequence）：5'-CCTCAAGAAGTTATTTCTACTGC-3'（253～272 bp，下劃線標注為PAM 區(qū)），合成二聚體后構建NtJAZ1基因敲除載體（pCBSG012-JAZ1）（圖1）。

圖1 NtJAZ1基因敲除載體示意圖Fig.1 Diagram of NtJAZ1 knockout Vector

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤轉(zhuǎn)化法［18］進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于抗性培養(yǎng)基上，挑選單菌落進行菌液PCR檢測，檢測后提取質(zhì)粒將其轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105 中，于YEB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4～0.6時用于共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。將Y2001 的無菌葉片剪成0.8 cm×0.8 cm 的小片，置于MS 培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，48 h 后將其轉(zhuǎn)移至活化的含有農(nóng)桿菌菌液的YEB培養(yǎng)基中侵染8 min，并及時吸干葉片表面殘留的菌液，放置于含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基（MS+Cef 0.500 00 g/L+Hyg 0.006 00 g/L + 6-BA 0.001 00 g/L + NAA 0.000 15 g/L）中，未用農(nóng)桿菌侵染的葉片分別置于含有潮霉素和不含潮霉素的培養(yǎng)基上作為對照1和對照2，待經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的葉片長出不定芽后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L）中繼續(xù)培養(yǎng)，待長出較為茂密的根系時移栽至室內(nèi)基質(zhì)土中繼續(xù)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，并將其命名為HN。

1.2.3 分子鑒定

通過CTAB 法提取所得轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，提取的DNA 用NtJAZ1特異性引物（F1：5’-CTAGGAAAGGCTAAAAAGAAACAGT-3’；R1：5’-CTGATATGGTGCAGTTGAAGTA-3’）進行PCR 擴增。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至深圳華大基因股份有限公司進行序列測定，將測序結(jié)果與茄科基因組網(wǎng)站中的NtJAZ1基因序列進行比對，篩選出純合突變單株。將測定出來的純合突變單株進行自交并收獲得到T1代煙草種子。

1.2.4 煙堿含量測定

選取六葉一心期煙苗葉片和根系進行總生物堿含量測定。將煙葉和根系放入105 ℃烘箱中烘30 min 進行殺青處理，于60 ℃烘至恒質(zhì)量。烘干后用碾子研磨粉碎，過直徑為0.25 mm 的過濾篩。準確稱取0.2 g粉末倒入15 mL試管中，加入100 μL煙堿內(nèi)標，1.5 mL10% NaOH 溶液和3 mL 甲基叔丁基醚，密封后充分振蕩5 min。室溫放置（24 ±2）h后，取上清溶液進行GC-FID分析。

1.2.5 煙堿合成相關基因表達量測定

利用植物總RNA 提取試劑盒（DP4332，天根生化科技有限公司）分別提取Y2001 和HN 的根系總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（NovoScript?II Reverse Transcriptase，上海近岸科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI GenBank 中的煙堿合成相關基因（NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT、NtQPT、NtODC和NtA622）序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR 引物，上、下游引物見表1，以NtL25（L18908）為內(nèi)參基因。RT-PCR 反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃15 s，58 ℃15 s，20 min 內(nèi)升至95 ℃，95 ℃15 s。采用2-△△CT法計算相關基因的相對表達量，設置3次重復。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.6 腺毛形態(tài)觀察

于煙苗十葉一心期分別取Y2001 和HN 長度約為10 cm 的葉片用于腺毛觀察，試驗操作參考婁亞楠等［19］的方法，將葉片置于0.2%的羅丹明B水溶液中浸染30 min，染色結(jié)束后用蒸餾水漂洗干凈，沖洗葉片表面未結(jié)合的染料。用濾紙輕輕吸干葉片表面水分后置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下進行腺毛觀察，并在觀察時隨機選擇3個視野對長柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛及非分泌型表皮毛的密度進行統(tǒng)計。

1.2.7 葉面化學成分分析

于煙苗十葉一心期分別挑選Y2001 和HN 各5株長勢良好的煙苗，用直徑5 cm 打孔器打取20 個葉圓片，用二氯甲烷進行浸提。浸提時向浸提液中加入1 mL 內(nèi)標（2.020 mg/mL 的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL 的正十七烷醇），然后加入10 g 左右無水硫酸鈉除水，定量濾紙過濾。將過濾后的溶液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液后用氮氣吹干。加入500 μL［V（DMF）∶V（BSTFA）=1∶1］的溶液，于75 ℃水浴中進行衍生化反應60 min，然后加入N,O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL。得到的樣品通過GC/MS 分析儀（色譜儀型號HP-5890，質(zhì)譜儀型號vc-70SE，美國Agilent 公司）進行葉面化學成分的定性和定量分析，色譜參數(shù)檢測參考王霄龍等［20］的方法。

1.2.8 蚜蟲抗性分析

活體植株蚜蟲選擇試驗：參考孫計平等［21］的方法并稍加修改。分別選取六葉一心期長勢一致的煙苗Y2001 和HN 各3 株，均勻放置于蚜蟲培養(yǎng)箱內(nèi)，每天20∶00 時調(diào)查并記錄煙苗上蚜蟲的數(shù)量，連續(xù)調(diào)查7 d。

離體葉片蚜蟲選擇試驗：采用葉碟法［22］分別選取六葉一心期長勢一致的Y2001 和HN 煙苗葉片各3片，均勻放置于直徑約25 cm的培養(yǎng)皿中。并在培養(yǎng)皿底部鋪設一層帶水的脫脂棉，以保持葉片活性。在培養(yǎng)皿中間放置100只饑餓2 h的蚜蟲，每隔2 h 統(tǒng)計不同株系葉片上蚜蟲的數(shù)量，計數(shù)5 次，共10 h。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

試驗均設置3 次生物學重復，所獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS17 軟件進行獨立樣本T檢驗和顯著性檢驗，使用GraphPad Prism 8.4.3 軟件進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtJAZ1基因敲除材料的創(chuàng)制與分子鑒定

采用農(nóng)桿菌介導法，將構建好的NtJAZ1基因敲除載體轉(zhuǎn)化Y2001，獲得了56 株耐受潮霉素的陽性植株（圖2）。提取陽性植株葉片的總DNA，利用NtJAZ1特異性引物進行PCR擴增并測序，有12株在gRNA 區(qū)域檢測到序列突變，基因編輯效率為21.43%。其中有1株煙苗的NtJAZ1基因序列發(fā)生堿基純合突變，NtJAZ1a和NtJAZ1b均在253～254 bp處插入1個A堿基，導致NtJAZ1基因功能缺失，并將其命名為HN（圖3）。

圖2 NtJAZ1基因敲除載體的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Genetic transformation of NtJAZ1 knockout vector

圖3 Y2001和部分突變株系測序峰圖Fig.3 Sequencing peak maps of Y2001 and the mutant plants

2.2 NtJAZ1基因敲除對腺毛發(fā)育的影響

對敲除植株苗期形態(tài)及腺毛發(fā)育進行觀察，結(jié)果如圖4A、4B 所示。從圖4 中可以發(fā)現(xiàn)，HN 和Y2001 在苗期形態(tài)上差異并不顯著，說明NtJAZ1基因敲除不會影響植株苗期的正常生長發(fā)育。與Y2001 相比，HN 腺毛密度顯著降低，其中腺毛總密度降低14.92%，長柄分泌型腺毛密度降低19.46%，但長柄分泌型腺毛腺頭更加飽滿且著色更深。非分泌型保護毛密度略有下降但變化不顯著，短柄分泌型腺毛密度基本不變。說明NtJAZ1基因敲除顯著降低了植株葉面腺毛密度，尤其是長柄分泌型腺毛的密度。

2.3 NtJAZ1基因敲除對葉面化學成分的影響

分別對Y2001 和HN 進行葉面化學成分測定，結(jié)果如圖5A、5B 所示。與Y2001 相比，HN 分泌物組分無明顯改變，均含西柏烷類、烷烴和蔗糖酯等物質(zhì)。另外，HN 分泌物總量以及各組分含量與Y2001 間差異均不顯著。說明NtJAZ1基因敲除不會影響植株葉面化學成分的組分和含量。雖然NtJAZ1基因敲除降低了葉面的腺毛密度，但同時也提高了腺毛的分泌能力，導致葉面化學成分含量無顯著變化。

圖5 Y2001和HN葉面化學成分分析Fig.5 Analysis of leaf surface chemical composition of Y2001 and HN

2.4 NtJAZ1基因敲除對煙苗生物堿合成的影響

分別選取六葉一心期的煙苗葉片與根系進行生物堿含量測量，結(jié)果如圖6A 所示。與Y2001 相比，HN 葉片中生物堿總量和煙堿含量分別提高20.54%和19.38%，變化達到極顯著水平，其余物質(zhì)變化不顯著；根系中HN 生物堿總量和煙堿含量分別提高30.94%和30.85%，變化達到極顯著水平，其余物質(zhì)變化不顯著。說明NtJAZ1基因敲除可促進植株煙堿的合成，且在根系中表現(xiàn)更為明顯。

根系煙堿相關合成基因表達量分析結(jié)果如圖6B所示。與Y2001相比，HN中NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的相對表達量均極顯著提高，而NtODC和NtA622的相對表達量無顯著變化。說明在敲除NtJAZ1基因后影響了JA 途徑中煙堿合成相關基因的表達，進而影響植株煙堿的合成。

2.5 NtJAZ1基因敲除對植株蚜蟲抗性的影響

活體植株蚜蟲選擇試驗結(jié)果如圖7A 和7B 所示。Y2001葉片下表面上的蚜蟲密度明顯高于HN，在7 d 內(nèi)Y2001 葉片上的蚜蟲數(shù)量極顯著高于HN，第7 天時Y2001 葉片上的蚜蟲數(shù)量達到最大值，HN的平均蚜蟲數(shù)量比Y2001減少28.25%。

圖7 Y2001和HN的蚜蟲抗性分析Fig.7 Analysis of aphid resistance of Y2001 and HN

離體葉片蚜蟲選擇試驗結(jié)果如圖7C、7D 所示。在接種2、4、6、8、10 h 時，Y2001 上的蚜蟲數(shù)量均極顯著高于HN，HN 的平均蚜蟲數(shù)量比對照減少47.19%。表明HN 在不同處理條件下蚜蟲數(shù)量均極顯著低于Y2001，說明NtJAZ1基因敲除后可顯著提高植株對蚜蟲的抗性。

3 討論

煙草生物堿對煙葉品質(zhì)和煙株抗性有重要影響［23］。通過對烤煙品種K326 中NtJAZ1基因進行編輯，創(chuàng)制了高煙堿K326 材料，明確了NtJAZ1基因敲除可顯著提高煙株煙堿含量，雖對植株形態(tài)沒有明顯影響，但其腺毛密度有所下降，暗示NtJAZ1對腺毛發(fā)生具有一定影響［16］。煙草腺毛發(fā)育受茉莉酸信號的誘導［24］，但NtJAZ1基因在其中的作用尚不明確。本試驗中采用CRISPR/Cas9技術對Y2001中NtJAZ1基因進行敲除，經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化和分子鑒定后，獲得了純合突變株系HN。發(fā)現(xiàn)Y2001和HN在苗期植株表型上并無明顯差異，說明NtJAZ1基因敲除不會影響植株苗期的正常生長發(fā)育，這與荊葉醒［25］對小麥TaJAZ1基因編輯后植株生長發(fā)育狀況良好的結(jié)果一致。對煙草Y2001和HN幼苗的葉片和根系進行煙堿含量檢測，發(fā)現(xiàn)葉片中HN煙堿含量提高19.38%，根系中HN煙堿含量提高30.85%。對NtJAZ1基因敲除后根系中煙堿相關基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，煙堿合成相關基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT等的表達量均極顯著增加，說明NtJAZ1基因敲除后影響了植株根系的JA信號轉(zhuǎn)導途徑，使JA信號下游煙堿合成基因表達量提高，從而導致HN植株中煙堿含量顯著增加，且根系中煙堿含量明顯高于葉片，這與胡國松等［26］的研究結(jié)果一致。

對Y2001 與HN 腺毛密度及葉面化學成分分析表明，與Y2001相比HN的總腺毛密度和長柄分泌型腺毛密度均有所降低，這與鄭淑心等［16］的研究結(jié)果一致。但其腺頭明顯變大且染色更深，葉面化學成分組分與含量與Y2001間差異不明顯。說明NtJAZ1基因敲除后會降低腺毛密度，但會使腺毛的分泌能力有所提高，導致葉面化學成分含量不受基因缺失的影響。由此推測，NtJAZ1對腺毛的物質(zhì)代謝具有一定的促進作用，但其中的分子機制還有待進一步研究。

另外，在本研究中通過蚜蟲接種試驗發(fā)現(xiàn)，HN在蚜蟲抗性方面明顯優(yōu)于Y2001。其中，活體植株蚜蟲選擇試驗中接種蚜蟲7 d 后HN 上的平均蚜蟲數(shù)量比Y2001 減少28.25%，離體葉片蚜蟲選擇試驗中HN 上的平均蚜蟲數(shù)量比Y2001 減少47.19%，均達極顯著水平。說明NtJAZ1基因敲除后可明顯提高煙草幼苗對蚜蟲的抗性，但其對田間蚜蟲及其他病蟲害的抗性如何還有待進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

通過CRISPR/Cas9技術敲除高分泌型烤煙品種Y2001 中的NtJAZ1基因獲得了純合株系HN。對HN株系進行室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，NtJAZ1基因敲除后植株腺毛密度顯著降低，分泌物含量無顯著變化，說明NtJAZ1基因敲除對腺毛發(fā)生有一定的抑制作用，但顯著提高了腺毛的分泌能力。同時對植株的煙堿合成能力有明顯促進作用，使根系中煙堿含量顯著提高，植株對蚜蟲的抗性也顯著增強。因此NtJAZ1基因是進行煙草品質(zhì)和抗性改良的重要靶點之一。