黃可珍，靳瑞瑞，陳 姍，張 帥，秦平偉，孫現(xiàn)超，陳國(guó)康，陳海濤

1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2 號(hào) 400715

2. 中國(guó)煙草總公司重慶市公司酉陽分公司，重慶市酉陽縣鐘多鎮(zhèn)和平路99 號(hào) 409800

3. 中國(guó)煙草總公司重慶市公司彭水分公司，重慶市彭水縣紹慶街道阿依路111 號(hào) 409600

4. 中國(guó)煙草總公司重慶市公司煙葉分公司，重慶市江北區(qū)五江路20 號(hào) 400023

煙草靶斑病是一種煙草葉部病害，感染該病害的煙葉形成有同心輪紋的不規(guī)則病斑，病斑后期破裂穿孔。該病害具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，在溫暖濕潤(rùn)條件下可反復(fù)侵染、大面積傳播，防治難度大［1］，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量，一旦流行會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。煙草靶斑病于2005年在我國(guó)遼寧丹東被發(fā)現(xiàn)［3］，隨后迅速蔓延至全國(guó)各煙區(qū)［4-5］。該病害病原菌的有性世代為瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］，無性世代為立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）是一個(gè)復(fù)合種，根據(jù)菌絲融合分類法［6］可將其劃分為不同的融合群，已報(bào)道的立枯絲核菌融合群共有14 個(gè)（AG-1～AG-13 和AG-BI）［7］，其中，引起煙草靶斑病的融合群為AG-2、AG-3、AG-4、AG-5 和AG-6［8-10］。關(guān)于煙草靶斑病病原菌融合群的相關(guān)研究已有報(bào)道。例如，Sun 等［10］通過形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS 序列分析明確引起貴州畢節(jié)煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-6 融合群。徐傳濤等［11］對(duì)四川瀘州煙草靶斑病病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)該病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），經(jīng)測(cè)定將其歸為AG-3融合群。2021至2022年重慶市涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣等煙區(qū)均發(fā)生了煙草靶斑病，為明確這些煙區(qū)煙草靶斑病的病原菌，采集發(fā)病株的典型發(fā)病葉片，采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，通過形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并調(diào)查重慶主要煙區(qū)煙草靶斑病的發(fā)生情況，以期掌握煙草靶斑病在重慶煙區(qū)的危害特點(diǎn)，為該病害的科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為云煙87。用于病原菌分離的煙草病葉樣品采集于重慶黔江區(qū)水市鄉(xiāng)、武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、萬州區(qū)孫家鎮(zhèn)、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣煙區(qū)煙田的感病煙株。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株保存于西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病害調(diào)查

參照文獻(xiàn)［12］的方法，于2022 年5 月至8 月對(duì)重慶市黔江區(qū)水市鄉(xiāng)、武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、萬州區(qū)孫家鎮(zhèn)、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣煙草靶斑病的發(fā)生時(shí)間及煙株發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法［13］分離病原菌。取病健交界處葉片組織，將其剪成小塊，經(jīng)75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇和5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉溶液消毒后，用無菌水漂洗3次。消毒后的葉片組織接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后將菌絲挑取至新的PDA 培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)5 d，獲得純化菌株。將純化菌株轉(zhuǎn)移到PDA斜面試管中保存。

1.3 純化菌株的致病性測(cè)定

將保存的菌株轉(zhuǎn)到PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，按照柯赫氏法則對(duì)其致病性進(jìn)行驗(yàn)證。采用菌絲塊接種法［14］，對(duì)健康云煙87 葉片進(jìn)行有傷接種。選取5～6 葉期煙株中下部葉片，用無菌針頭刺4 個(gè)小孔，再用打孔器取直徑為5 mm 的菌絲塊，菌絲面朝下置于葉片傷口處，將棉花用無菌水濕潤(rùn)后覆蓋在菌絲塊上保濕，對(duì)照處理接種直徑為5 mm 的無菌PDA 培養(yǎng)基塊。每個(gè)處理接種2 片葉，重復(fù)3 次。將接種后的煙株置于28 ℃恒溫溫室中，葉片發(fā)病后，于病健交界處分離病原菌進(jìn)行鑒定。

1.4 菌絲融合群的鑒定

采用玻片對(duì)峙法［15］將1.2 節(jié)中的純化菌株與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，24 h后觀察其菌絲融合情況。

1.5 病原菌的16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

隨機(jī)選取13 個(gè)純化菌株在PDA 培養(yǎng)基上于28 ℃條件下培養(yǎng)，7 d 后刮取菌絲，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司真菌基因組DNA 提取試劑盒提取病原菌DNA，提取過程嚴(yán)格按照說明書操作。采用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)病原菌的rDNA-ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR 產(chǎn)物用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。將得到的序列使用NCBI網(wǎng)站的Blastn在線工具進(jìn)行同源性比對(duì)，并下載相關(guān)菌株的基因序列，利用MEGA 11軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查及病原菌的分離和純化

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黔江區(qū)水市鄉(xiāng)、武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、萬州區(qū)孫家鎮(zhèn)、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣均有煙草靶斑病發(fā)生。其中，彭水苗族土家族自治縣煙株發(fā)病時(shí)間為5 月中下旬，酉陽土家族苗族自治縣煙株發(fā)病時(shí)間在6月上旬，黔江區(qū)水市鄉(xiāng)煙株發(fā)病時(shí)間為6月上旬，萬州區(qū)孫家鎮(zhèn)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)和武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)煙株發(fā)病時(shí)間為7月中下旬。該病害在酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣的煙株發(fā)病率為40%～60%，而其他煙區(qū)該病害并未大面積流行，煙株發(fā)病率為5%～15%。對(duì)采集的病葉進(jìn)行病原菌分離、純化，共獲得79 個(gè)菌株，詳細(xì)信息見表1。病原菌在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落初期為白色，后變?yōu)辄S褐色（圖1A），菌絲間夾角呈銳角或直角，分支處有明顯縊縮，且分支附近有隔膜，不產(chǎn)生孢子（圖1B），與Parmeter 等［6］描述的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）形態(tài)特征一致。

表1 病原菌的分離株及其地理來源Tab.1 Isolates of pathogenic fungi and their geographical origins

圖1 Rhizoctonia solani菌落及菌絲形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of fungal colonies and mycelia of Rhizoctonia solani

2.2 純化菌株的致病性測(cè)定

代表菌株YYCL11 的致病性測(cè)定結(jié)果顯示，健康煙草葉片在接種菌絲塊3 d后開始發(fā)病，前期病斑為不規(guī)則水漬狀，有明顯同心輪紋，且周圍伴有褪綠暈圈，后期病斑中心穿孔（圖2C），與病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)的田間發(fā)病葉片癥狀一致（圖2A、圖2B），對(duì)照未發(fā)?。▓D2D）。從接種發(fā)病的煙葉中再次分離、純化得到的菌株菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)與菌株YYCL11 相同，證明菌株YYCL11對(duì)煙草葉片具有致病性，是引起重慶煙區(qū)煙草靶斑病的病原菌。

圖2 煙草靶斑病田間癥狀及菌株YYCL11的致病性測(cè)定Fig.2 Field symptoms of tobacco target spot and pathogenicity determination of strain YYCL11

2.3 菌絲融合群的鑒定

通過玻片對(duì)峙法，測(cè)定純化菌株與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲融合情況，發(fā)現(xiàn)采集自重慶萬州區(qū)孫家鎮(zhèn)、黔江區(qū)水市鄉(xiāng)、武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣的煙草靶斑病病原菌菌株均可與AG-3 融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲融合（圖3A），但不與AG-2-1 融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲融合（圖3B）。

圖3 菌絲融合群測(cè)定Fig.3 Determination of anastomosis group

2.4 病原菌的16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

對(duì)選取的13 個(gè)純化菌株DNA 的ITS 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段長(zhǎng)度大約為710 bp。Blastn 同源性比對(duì)結(jié)果顯示，13 個(gè)菌株的rDNA-ITS 序列與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）或其有性世代瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）的同源性高達(dá)97%～100%。以Rhizoctonia solaniAG-6 作為外群，使用MEGA 11 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果顯示13個(gè)菌株與Rhizoctonia solaniAG-3以97%的支持率聚于同一分支上。

圖4 基于16S rDNA構(gòu)建的13個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 13 isolates of Rhizoctonia solani based on 16S rDNA sequences

3 討論

本研究中調(diào)查的6 個(gè)煙區(qū)均有煙草靶斑病發(fā)生，可能是由于這些煙區(qū)為高海拔山區(qū)，6 至7 月份常出現(xiàn)連續(xù)降雨的情況，導(dǎo)致空氣濕度大、溫度偏低，有利于該病害在田間迅速流行。通過形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，引起重慶煙區(qū)煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群，而引起四川宜賓煙草靶斑病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）為AG-5融合群［9］，引起廣西羅城煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2 和AG-4 融合群［16］。引起不同煙區(qū)煙草靶斑病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）隸屬于不同菌絲融合群，這可能與地理環(huán)境及煙草品種等因素有關(guān)，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病在重慶市武隆區(qū)接龍鄉(xiāng)、涪陵區(qū)武陵山鄉(xiāng)、黔江區(qū)水市鄉(xiāng)、酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣均有發(fā)生。從這些煙區(qū)的發(fā)病煙株上采集的病葉通過分離、純化及致病性測(cè)定后，得到79 個(gè)病原菌菌株，通過病原菌的形態(tài)特征觀察，將病原菌鑒定為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）。通過菌絲融合群測(cè)定以及rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，明確病原菌歸屬于AG-3 融合群，且病原菌菌株與Rhizoctonia solaniAG-3 的同源性達(dá)97%以上。因此，確定引起重慶煙區(qū)煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群。