◆作者：羅敏意

◆單位：中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心

氯 霉 素（chloramphenicol）、甲砜霉素（thiamphenicol）、氟苯尼考（florfenicol）是一種酰胺醇類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較好的抑制作用，曾被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。然而，氯霉素可引起再生障礙性貧血、灰嬰綜合征等嚴(yán)重不良反應(yīng)，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告明令禁止食品動(dòng)物中檢出氯霉素及其鹽、酯。甲砜霉素和氟苯尼考在不同的動(dòng)物源性食品中限量不同。

目前，國(guó)內(nèi)已有畜禽產(chǎn)品和水產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定的研究，而脆肉鯇魚肉中上述目標(biāo)組分殘留量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。中山市脆肉鯇養(yǎng)殖面積約3 萬畝，占全省脆肉鯇養(yǎng)殖面積約90%，為此，在中山市開展脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定方法的研究具有重要意義，對(duì)日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及監(jiān)管都有重要意義，也為脆肉鯇中其它抗生素類藥物殘留測(cè)定方法的建立提供參考（李盛安等，2022；董梅等，2022）。

1 儀器與試劑

液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀（QQQ6430，安捷倫科技有限公司）；電子天平（300JJ，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（H1850R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；勻漿機(jī)（T18 basic，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-210，瑞士步琪有限公司）；旋渦混合器（945601，美國(guó)Talboys 公司）；塑料離心管（50 mL，常德比克曼生物科技有限公司）；雞心瓶（100 mL，北京博美玻璃有限公司）；具塞三角瓶（250 mL，北京博美玻璃有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷（色譜純，美國(guó)默克公司）；氯化鈉（AR，廣州化學(xué)試劑廠）；C18 固相萃取小柱（500 mg，6 mL，CNW 公司）；0.22μm 尼龍針式過濾器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液均為壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品提取

稱取5 g 已均質(zhì)的脆肉鯇魚肉（精確至0.01 g），置于50 mL塑料離心管中，加入100μg/mL氯霉素- D5內(nèi)標(biāo)工作液250μL，再加入5 mL 乙腈和5 mL 4%氯化鈉水溶液，渦旋振蕩2min，10℃9000 r/min 離心5 min，將上層液體轉(zhuǎn)移至另一塑料離心管，加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩1 min，10℃9000 r/min 離心5 min，棄上層液體后加入5 mL 水飽和乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，10℃9000r/min 離心5 min，將上層液體轉(zhuǎn)移至雞心瓶，45 ℃200 bar旋蒸至干，加入4 mL5%乙腈水（V∶V=5∶95）復(fù)溶，備用。

2.2 樣品凈化

C18 固相萃取小柱分別用5 mL 甲醇和5 mL 水活化，樣液（2.1）過小柱，用3 mL 超純水洗滌小柱，擠干小柱后加入2.5 mL 50%甲醇水（V∶V=1∶1）洗脫，收集洗脫液并取適量過0.22 μm 濾膜后，供LC-MS/MS 測(cè)定。同時(shí)，做樣品空白試驗(yàn)。

2.3 測(cè)定

2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18，46 mm ×100 mm，18-Microm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為超純水；流速：0.60 mL/min；進(jìn)樣量：20μL。分離氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度條件

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：-400 V；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力：40 psi；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5 特征離子質(zhì)量色譜圖

表2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5 的質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理方法的選擇

朱志偉等（2007）研究表明，脆肉鯇魚肉中富含脂肪和蛋白質(zhì)，其粗蛋白、脂肪和灰分含量均比普通草魚高，水分含量則低于普通草魚。為更好地去除魚肉中的脂肪和蛋白質(zhì)，本文比較了多種提取凈化方法，最終選擇了乙腈水提取、正己烷除脂、乙酸乙酯反萃取的方法對(duì)脆肉鯇魚肉進(jìn)行前處理，有效去除魚肉中的脂肪和蛋白質(zhì)等成分，提高了目標(biāo)組分的提取效率。此外，樣品提取、凈化效果良好，不僅延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命，也減輕了儀器維護(hù)的壓力，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

3.2 線性回歸方程和檢出限

配制濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10μg/L 的系列空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液，上機(jī)測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)組分和氯霉素-D5峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以濃度比為橫坐標(biāo)，計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

采用信噪比的方法來評(píng)估方法檢出限，當(dāng)目標(biāo)組分的特征離子峰與基線噪音值的比值＞3時(shí)為方法檢出限，信噪比＞10 為方法定量限（李龍，2022）。

目標(biāo)組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、方法檢出限及方法定量限見表3。結(jié)果表明，在0.1～10 μg/L 范圍內(nèi)線性回歸方程呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，方法檢出限均為0.1μg/kg，方法定量限均為0.3μg/kg，能滿足日常大批量脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定的需要。

表3 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及方法定量限

3.3 方法回收率和精密度

稱取5 g 不含氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的脆肉鯇魚肉于50 mL 塑料離心管中，添加高、中、低3 個(gè)水平（25.0，12.5，7.5 ng）的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6 次。結(jié)果表明，目標(biāo)組分的加標(biāo)回收率在80.3%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.766 %～3.27 %，該方法具有良好的回收率和精密度（詳見表4）。

表4 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均加標(biāo)回收率及精密度

3.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文建立的LC-MS/MS法測(cè)定中山市魚塘養(yǎng)殖的30 份脆肉鯇魚肉樣品，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均未檢出。

制備加標(biāo)脆肉鯇魚肉樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品中各目標(biāo)組分能被有效分離，基本無雜峰干擾，回收率較高，說明該方法運(yùn)用到實(shí)際樣品測(cè)定中能得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。

4 結(jié)論與討論

本文建立了脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康腖C-MS/MS 測(cè)定方法。該方法具有提取效高、定量準(zhǔn)確及節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。本文選擇合適的試劑、耗材對(duì)樣品前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，選用合適的色譜柱和質(zhì)譜測(cè)定條件，有效分離目標(biāo)組分，大大提高了測(cè)定準(zhǔn)確率，能滿足日常大批量檢測(cè)的需要，也為其它抗生素類藥物殘留測(cè)定方法的建立提供參考。

參考文獻(xiàn)：（略）