劉宇航，陳曉林，陳建酬，滑 榮，李同好，馮 鑫

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.北京動物園管理處圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100044）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是目前常見的一種炎癥性腸病，具有病程長、反復(fù)發(fā)作，且長期患病易導(dǎo)致結(jié)腸癌的特點［1］。該病發(fā)病機制目前尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎的病情發(fā)展與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平紊亂有關(guān)［2］。研究表明，腸道菌群發(fā)生紊亂會引起腸黏膜屏障的損傷，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子失衡，加重腸黏膜炎性損傷［3］。目前沒有治療潰瘍性結(jié)腸炎的特效藥，主要應(yīng)用免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、水楊酸類藥物進行治療，但預(yù)后較差，治療效果不理想［4-6］。UC 為炎癥性腸病，故本研究選擇清熱解毒、抗炎類中藥，匯為中藥組方，以期可以在中藥治療UC 中提供參考。

五味子果實提取物五味子甲素，是一種生物活性的木質(zhì)素，具有抗炎、抗自由基等作用［7］。魚腥草屬三白草科，主產(chǎn)于云貴川及南方地區(qū)，味辛、微寒，其含有的多糖對葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有一定的改善作用［8］。土茯苓含有的植物類甾醇類物質(zhì)具有消除炎癥促進傷口愈合的作用［9］。荷葉是睡蓮科植物蓮的葉片，常作為中藥材使用，具有去熱利濕等功效，荷葉中含有黃酮和生物堿類成分，具有良好的抗氧化和抗炎活性［10］。金錢草是報春花科植物，味苦、酸、微寒，具有利濕、解毒消腫的功效［11］。杜仲是我國一種特有樹種，是杜仲科下杜仲屬植物，其樹皮作為一種珍貴的中藥材，是我國特有的食物藥用植物資源，其活性成分豐富，藥理作用突出，具有抗氧化、抗疲勞、抗高血壓、抑菌、抗骨質(zhì)疏松等多種療效［12］。我國豆科植物廣州相思子的干燥全株雞骨草，有保肝、抗炎抗菌、抗氧化、抗病毒、活血化瘀、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［13］。蒲公英是菊科的一種多年生草本植物，主要產(chǎn)地在北半球溫帶至亞熱帶地區(qū)，在我國多地均有分布，作為一種藥食同源的植物，其在我國食用以及藥用方面都有幾千年的歷史，其莖葉、花和根中含有多種成分，如酚酸黃酮類、甾醇類化合物等，有抗癌、抗風(fēng)濕、清熱解毒、抗炎，以及對腸道微生態(tài)的平衡有一定意義［14］。

本研究主要探討復(fù)方中草藥（五味子、杜仲、土茯苓、金錢草、魚腥草、雞骨草、蒲公英、荷葉按一定比例配制而成）對DSS 誘導(dǎo)小鼠腸炎的抗氧化指標(biāo)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物的影響，為復(fù)方中藥的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

SPF 級BALB/c 雄性小鼠42 只，體重為11～13 g，21 日齡，由廣東省實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑

葡聚糖硫酸鈉購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；復(fù)方中草藥，由五味子、杜仲、土茯苓、金錢草、魚腥草、雞骨草、蒲公英、荷葉按一定比例經(jīng)超微粉碎配制而成。

總超氧化物歧化酶測定試劑盒（A001-1-1）、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒（A005-1-2）、丙二醛測定試劑盒（A003-1-1）及總抗氧化能力測定試劑盒（A015-3-1）、過氧化氫酶測定試劑盒（A007-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（C009-2-1）購自于南京建成研究所。小鼠腫瘤壞死因子α ELISA 檢測試劑盒（ml002095）、小鼠白細(xì)胞介素10 ELISA 檢測試劑盒（ml037873）、小鼠白細(xì)胞介素6 ELISA 檢測試劑盒（ml064292）及小鼠白細(xì)胞介素4 ELISA 檢測試劑盒（ml063156）購自于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

將42 只21 日齡雄性BALB/c 小鼠，隨機分為三組：對照組、模型組（DSS 組）和治療組，每組7 個重復(fù)，每個重復(fù)2 只小鼠。試驗前6 天為適應(yīng)期，所有小鼠自由飲用滅菌水，試驗期前5 天DSS 組和治療組小鼠飲用3.5%DSS 水溶液，試驗期后7 天DSS 組小鼠恢復(fù)飲用滅菌水，治療組小鼠飲用中草藥溶液（30 mg/mL）。

1.3 樣品采集

1.3.1 小鼠生長性能檢測

試驗期間每日飼喂前對每只小鼠進行空腹稱重，記錄小鼠每天的采食量。

1.3.2 小鼠糞便性狀和便血情況記錄

試驗期間，每天記錄各組小鼠的糞便性狀及便血情況，計算疾病活動指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評分。DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)［15］見表2。

表1 疾病活動指數(shù)（DAI）評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 復(fù)方中草藥對小鼠生長性能的影響

1.3.3 小鼠血液采集

試驗最后一天，每個重復(fù)隨機選取一只小鼠，摘取眼球采血，將血液靜置1 h 后，3 000 r/min 離心20 min，吸取血清分裝于1.5 mL 的試管中，于-20 ℃保存待測。

1.3.4 小鼠結(jié)腸組織及盲腸內(nèi)容物采集

采血后，頸椎脫臼處死小鼠，于結(jié)腸中段采集2 cm 左右的組織樣品，用滅菌生理鹽水沖洗干凈，置于4%甲醛緩沖溶液中固定，用于HE 染色及石蠟切片制作。收集處死小鼠的盲腸內(nèi)容物（n=7），用于后續(xù)16S rRNA 測序分析。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 小鼠生長性能指標(biāo)測定

計算小鼠的平均日增重（Average Daily Gain，ADG），平均日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）以及料重比（Feed/Gain，F(xiàn)/G）。

1.4.2 小鼠抗氧化指標(biāo)測定

血清總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic Oxaloacetic Transaminase，GOT，又稱AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic Pyruvic Transaminase，GPT，又稱ALT）含量，均采用購買自南京建成研究所試劑盒說明書進行測定。

1.4.3 小鼠血清免疫指標(biāo)測定

血清腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）含量，均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測。

1.4.4 小鼠腸道形態(tài)觀察

將所采集的結(jié)腸標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片、常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色等處理后，制成石蠟切片。在光學(xué)顯微鏡下用明美數(shù)碼分析系統(tǒng)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）在40 倍視野下拍攝圖片，測量結(jié)腸絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.4.5 盲腸微生物測序

提取盲腸微生物基因組總DNA 并檢測DNA 質(zhì)量與濃度后進行文庫構(gòu)建。使用HiSeq2500 的PE250 進行測序。過濾掉低質(zhì)量reads 后，進行序列拼接、序列過濾及去嵌合體等處理，得到優(yōu)化序列。使用Qime-Uclust 算法以97%的一致性優(yōu)化序列聚類成為操作分類單元（OTU），后續(xù)使用QIIME（V1.9.1）進行OTU 分析、Alpha 多樣性分析及菌群結(jié)構(gòu)分析等。

1.5 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Excel 初步整理試驗數(shù)據(jù)后，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，多重比較采用Tukey 法，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05 為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對小鼠生長性能的影響

由表2 可知，各組小鼠的體重和平均日增重沒有顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，DSS 組和治療組小鼠平均日采食量顯著降低（P<0.05）。

2.2 復(fù)方中草藥對DAI 評分的影響

由表3 可知，試驗前各組小鼠的DAI 評分均為0，試驗期間對照組小鼠的DAI 評分均為0 分，在試驗的第7、13 天DSS 組和治療組小鼠的DAI 評分均高于對照組。同時，第13 天治療組評分低于DSS組，但兩組評分均顯著高于對照組。

表3 復(fù)方中草藥對小鼠DAI 評分的影響

2.3 復(fù)方中草藥對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4 可知，與對照組相比，DSS 組和治療組的血清GSH-Px 水平顯著升高。相比于對照組，治療組T-AOC 顯著降低，而DSS 組與對照組差異不顯著。T-SOD、MDA、CAT、AST/GOT、ALT/GPT 含量在各組間差異不顯著（P>0.05）。

表4 復(fù)方中草藥對小鼠血清抗氧化指標(biāo)和肝功能指標(biāo)的影響

2.4 復(fù)方中草藥對小鼠血清炎癥因子的影響

由表5 可知，與對照組相比，DSS 組和治療組小鼠血清IL-6 水平均顯著提高（P<0.05）。TNF-α、IL-4 和IL-10 含量在各組間均沒有顯著差異（P>0.05）。

表5 復(fù)方中草藥對小鼠血清炎癥因子的影響

2.5 復(fù)方中草藥對小鼠盲腸和結(jié)腸長度的影響

由表6 可知，各組小鼠間盲腸長度與結(jié)腸長度均無顯著差異（P>0.05）。

表6 復(fù)方中草藥對小鼠盲腸與結(jié)腸長度的影響

2.6 復(fù)方中草藥對小鼠腸道形態(tài)的影響

由表7 可知，各組小鼠間絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均無顯著差異（P>0.05）。從小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)圖1 中可以看出，對照組的結(jié)腸組織形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)生潰瘍。DSS 組與治療組小鼠結(jié)腸中均存在炎癥，其中，治療組的炎癥程度較輕。

圖1 小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)（40×）

表7 復(fù)方中草藥對小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.7 OTU 多樣性、相似性和Alpha 多樣性分析

對小鼠盲腸內(nèi)容物進行16 SrRNA 基因測序，比較對照組、DSS 組與治療組之間微生物差異。在數(shù)據(jù)過濾、質(zhì)量控制和嵌合體序列去除后，獲得稀疏折射曲線顯示，各組內(nèi)的細(xì)菌組成具有足夠的OTU覆蓋率，如圖2a 所示。OTU 總數(shù)為2012 個，在所有組中檢測到839 個共享OTU，如圖2b 所示。使用Bray-Curtis 相似性方法進行的主坐標(biāo)分析表明，第一主成分和第二主成分分別解釋了樣本之間21.81%和17.99%的變化。如圖2c 所示，來自對照組的樣品可以與外顯子組區(qū)別開來，而對照組和治療組均不能完全與DSS 組分開。

圖2 OTU 多樣性、相似性分析和Alpha 多樣性

α 多樣性是群落生態(tài)學(xué)中常見的物種豐度指標(biāo)，也是物種豐度和均勻度的綜合指標(biāo)，主要包括Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。DSS 組的Shannon 指數(shù)顯著降低（P<0.05）。Alpha多樣性數(shù)據(jù)如表8 所示，goods_coverage 被用作測序深度的指標(biāo)，其值越接近1，測序深度越合理。Ace指數(shù)代表菌群豐富度，Ace 指數(shù)越大，菌群的豐富度越高，相較對照組，DSS 組的Ace 指數(shù)顯著降低（P<0.05）?；緶y序深度覆蓋了樣本中的所有物種，表8 表明測序深度足夠。

表8 復(fù)方中草藥對小鼠Alpha 多樣性的影響

2.8 腸道菌群差異性分析

門和屬水平的微生物分類組成數(shù)據(jù)如圖3 所示。對門水平豐度前10 的菌群進行統(tǒng)計，其中擬桿菌門和厚壁菌門占比最大（>75%），擬桿菌和厚壁菌為優(yōu)勢菌門，這與趙曉等［16］的研究一致。治療組的厚壁菌豐度高于對照組和DSS 組。對屬水平豐度前10 的菌群進行統(tǒng)計分析，治療組的乳酸菌屬豐度顯著高于對照組和DSS 組。

圖3 盲腸內(nèi)容物菌群門和屬的分類組成

3 討論

在UC 的治療中，西醫(yī)以抑制免疫和抗炎為主要手段，活躍期的治療方法與緩解期相似。中醫(yī)則根據(jù)活動期和緩解期采用兩步序貫治療法。在活動期，注重內(nèi)外治療；在緩解期，主要集中于斂瘡生肌?？偟膩碚f，中醫(yī)對UC 的認(rèn)識比較深入，治療時會結(jié)合患者自身情況，這充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨證治療的特點和整體觀念。目前通過服用中草藥治療UC 已經(jīng)成為一種安全且有效的方法之一。如吳東升等［17］采用芍藥湯通過抑制HIF-1α 調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡治療UC，李敏等［18］通過血竭對UC 大鼠療效及血清TNF-α、IL-10 的表達(dá)的影響研究以及劉建平等［19］利用泄?jié)峤舛痉綄C 大鼠血清TLR4、MD2、IL-13 及NF-κB的影響等研究中表明，中草藥對治療UC 有積極意義。

3.1 復(fù)方中草藥對小鼠生長性能的影響

在本試驗中，與茶亞非等［20］對DSS 自由飲用與灌喂誘導(dǎo)小鼠UC 模型的比較的研究結(jié)果一致的是，灌喂DSS 成功誘導(dǎo)小鼠了UC 模型，降低小鼠體重、采食量及結(jié)腸長度，提高DAI 評分及結(jié)腸組織病理學(xué)評分。與對照組相比，DSS 組小鼠的平均日采食量明顯降低，但是對體重和ADG 的影響不顯著，這與陳素傲等［21］DSS 誘導(dǎo)鼠UC 模型的研究的結(jié)果相似。DAI 評分是評價小鼠UC 模型的重要指標(biāo)，評分反應(yīng)小鼠體重變化、糞便稀軟的程度以及糞便出血情況，分值高低與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈正比。DAI 評分結(jié)果顯示DSS 誘導(dǎo)能顯著提高DAI 評分，而灌服中草藥后DAI 評分有所下降，這說明本中草藥對緩解小鼠腸炎有一定的積極意義。

3.2 復(fù)方中草藥對小鼠血清抗氧化和肝功能指標(biāo)的影響

在小鼠相關(guān)血清生化指標(biāo)中，T-AOC 的水平直接反應(yīng)機體抗氧化能力的強弱，MDA 的水平反應(yīng)機體過氧化的程度。機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)包括CAT、T-SOD 以及GSH-PX，它們互相協(xié)作使自由基在體內(nèi)實現(xiàn)動態(tài)平衡，其活性可以反映機體內(nèi)清除自由基的能力。本次試驗結(jié)果中，DSS 成功誘導(dǎo)了小鼠結(jié)腸炎并降低了機體的抗氧化能力。與對照組相比，治療組的GSH-Px 水平顯著升高，T-AOC 顯著降低。AST、ALT 的活性與肝細(xì)胞的損傷程度密切相關(guān)［22］。肝細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，血清中的AST、ALT 的水平越高。魚腥草的不同溶劑提取物以及其生物活性分子，已經(jīng)被證明可以有效對抗各種炎癥。吳蘋等［23］發(fā)現(xiàn)魚腥草多糖在保護肝功能方面有一定的作用。在張麗靜等［24］對荷葉堿防止小鼠高脂血癥作用及其機質(zhì)的研究和張曉云等［25］對五味子甲素對結(jié)腸炎大鼠的氧化應(yīng)激水平的調(diào)控作用的研究中表明，荷葉和五味子作為中草藥，可有效的改善超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及GSH-Px 的活性進而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。而給小鼠灌服含有五味子、魚腥草以及荷葉的中草藥并未明顯改善這一結(jié)果，說明復(fù)方中藥的使用劑量和配比有待進一步探索。

3.3 復(fù)方中草藥對小鼠血清炎癥因子的影響

研究表明，結(jié)腸炎與促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-6）的上調(diào)與抗炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）的下調(diào)相關(guān)［26］。IL-6 的水平越高表明體內(nèi)的炎癥程度越高。結(jié)果如表5 所示，與對照組相比，DSS 組與治療組小鼠的血清中促炎因子IL-6 的水平顯著升高，表明DSS 促進了炎癥的發(fā)生。這與董晶等［27］研究魚腥草對DSS 誘導(dǎo)小鼠UC 模型中的結(jié)果相似。在閆慶梓等［28］對于荷葉提取物抗炎活性的研究和劉永生等［29］對五味子甲素對UC 大鼠的保護作用的研究中，五味子和荷葉的存在有效降低了IL-6 的水平。而本試驗治療組小鼠的血清中抗炎因子IL-4 以及IL-10 的水平?jīng)]有提升，IL-6 的水平也未降低，可能的原因是小鼠體內(nèi)炎癥過重，魚腥草以及五味子與荷葉的量不足以緩解炎癥。

3.4 復(fù)方中草藥對小鼠腸道長度和結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)腸的長度也可以用來評價UC，UC 會導(dǎo)致小鼠腸壁變厚，長度縮短。梁晗業(yè)等［30］研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素可顯著抑制結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸縮短。本試驗中三組小鼠的盲腸長度和結(jié)腸長度均無顯著差異，可能由于小鼠結(jié)腸收縮劇烈，而本復(fù)方中草藥中五味子的含量不足以抑制結(jié)腸收縮。腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)不僅影響腸道物理屏障功能，還影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［31］。絨毛高度與隱窩深度比值下降，黏膜則很可能受損，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻及機體消化能力減弱，而比值上升，則意味著腸道吸收面積增大，利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。絨毛越長的動物的消化吸收能力越強，而隱窩變淺表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強。而本試驗中小鼠各組間的絨毛長度、隱窩深度和兩者比值均無顯著差異。

3.5 復(fù)方中草藥對小鼠盲腸微生物的影響

Eun，C.S［32］研究表明腸道微生物與腸道炎癥密切相關(guān)。宿主與腸道微生物之間存在動態(tài)平衡，腸組織損傷往往伴隨腸道菌群發(fā)生改變。UC 患者的腸道菌群的特征之一就是厚壁菌門/擬桿菌門的比例降低，換而言之厚壁菌門/擬桿菌門比例升高，則有利于對抗UC 帶來的影響。本試驗結(jié)果顯示，DSS 刺激下大鼠腸道菌群厚壁菌門/擬桿菌門比例為85%，而治療組的厚壁菌門/擬桿菌門比例提升至137%，說明本試驗中的中草藥有助于恢復(fù)DSS 刺激引起的大鼠結(jié)腸腸道菌群優(yōu)勢菌厚壁菌門與擬桿菌門的比例。而小鼠腸道中，促炎細(xì)菌增加，抗炎細(xì)菌種類減少，主要是因為厚壁菌的減少和擬桿菌的增加。在小鼠灌服中草藥后可以看出小鼠的厚壁菌豐度顯著升高。與DSS 組相比，治療組的乳桿菌屬豐度顯著升高。乳桿菌是厚壁菌門中的有益菌，具有抗致病菌，增強上皮屏障、調(diào)節(jié)免疫等功能，其主要通過分泌短鏈脂肪酸阻止致病菌侵入與增殖，減少腸道炎癥的發(fā)生［33］。有研究表明Alistipes 在結(jié)直腸癌中有致病性。與對照組相比，DSS 組的Alistipes 豐度顯著升高，而治療組Alistipes 豐度相對DSS 組顯著降低，這表明本試驗中中草藥對于調(diào)節(jié)DSS 誘導(dǎo)小鼠的腸道菌群有積極作用。

4 結(jié)論

本試驗所用復(fù)方中草藥對于改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠UC 有積極意義，但還需要進一步調(diào)整中藥成分及成分比例。