朱海金, 王詔玉, 單文琪, 王影, 常明, 汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 兒科, 2. 中心實驗室, 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

支氣管哮喘是一種異質(zhì)性疾病,通常以氣道慢性炎癥為主要特征,多種細(xì)胞和細(xì)胞因子在其中發(fā)揮作用,尤其是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞[1]。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,既往認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡是造成哮喘的免疫學(xué)發(fā)病基礎(chǔ),且哮喘的進(jìn)展伴隨著T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化,釋放Th2型細(xì)胞因子[2-3]。但中重度哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞增多、Th17細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22增多[4]。近年來研究報道,Th17/Treg細(xì)胞失衡也參與哮喘的發(fā)病[5],但其具體作用機(jī)制尚未闡明。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是轉(zhuǎn)錄物長度超過200 nt且缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子,已成為多種生理和病理過程的關(guān)鍵分子,并參與包括哮喘在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制[6-7]。與lncRNA家族中的大多數(shù)成員不同,lncRNA MALAT1在各種哺乳動物中大量表達(dá)并在進(jìn)化上保守,是最早發(fā)現(xiàn)的與人類疾病相關(guān)的lncRNAs之一,尤其在各種癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[8]。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)食物過敏小鼠高表達(dá)MALAT1,其可能通過促進(jìn)樹突細(xì)胞分泌IL-6,并抑制Treg的調(diào)節(jié)功能,從而誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1在哮喘小鼠脾組織中高表達(dá),高表達(dá)的MALAT1與哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子Rorc/Foxp3的變化密切相關(guān)。由此,MALAT1可能通過誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞的平衡,參與哮喘小鼠炎癥的發(fā)生。本研究通過構(gòu)建哮喘小鼠模型,探討Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、lncRNA MALAT1在哮喘發(fā)病中的作用,為哮喘干預(yù)提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性BALB/c小鼠20只,6～8周齡,體重20～25 g,購自江蘇大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(蘇)2018-0008,飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。動物實驗按照《實驗動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行,并經(jīng)江蘇大學(xué)動物研究倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號:UJS-IACUC-2021041201)。

1.2 主要試劑與儀器

卵清蛋白(美國Sigma公司),RPMI 1640完全培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司);佛波酯/離子霉素混合物和布雷非德菌素混合液(聯(lián)科生物技術(shù)公司);流式染色熒光抗小鼠抗體CD4-FITC、Foxp3-PE、GATA3-PE、IL-17-PE(美國eBioscience公司),流式染色熒光抗小鼠抗體CD45-BV421(美國Biolegend公司),Trizol(諾唯贊生物科技公司),引物MALAT1、GAPDH(擎科生物科技公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(諾唯贊生物科技公司)。定量PCR儀和離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司),正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司),流式分選儀(美國BD公司)。

1.3 哮喘小鼠模型建立

將小鼠隨機(jī)分為對照組和哮喘組,每組10只。參照文獻(xiàn)[10]方法,分別在第0、7、14天,對照組小鼠給予腹腔注射0.2 mL PBS,哮喘組小鼠給予腹腔注射0.2 mL卵清蛋白混合液(50 μg V級卵清蛋白溶解于0.2 mL PBS中,并加入10%氫氧化鋁凝膠配制成混懸液)。從第21天開始,哮喘組給予2.5%卵清蛋白溶液(溶于PBS)霧化進(jìn)行哮喘激發(fā),1次/d,每次霧化40 min,持續(xù)至第27天,共計7 d。最后一次霧化后次日處死所有小鼠。

1.4 HE染色與PAS染色觀察肺組織病理變化

取出肺組織固定于4%甲醛溶液中,常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片,常規(guī)HE染色后置于熒光顯微鏡下觀察小鼠肺組織炎癥變化。PAS染色步驟:將染色的肺組織浸泡在二甲苯中10 min后取出,用無水乙醇浸泡洗脫二甲苯后分別放入95%、85%、70%乙醇溶液中進(jìn)行水化。將高碘酸溶液滴加在水化后的肺組織切片,進(jìn)行染色15 min,用自來水沖洗5 min,然后浸入蒸餾水洗2次,最后擦去切片表面的殘留水分。滴加Schiff氏液后靜置10 min,用流水沖洗5 min,沖洗晾干后滴加蘇木素液染色3 min,用流水沖洗5 min。染色完畢后,需對肺組織切片采取梯度脫水處理,分別在80%、95%以及無水乙醇中浸泡5 s、2 min和2 min。用二甲苯浸泡脫水后的肺組織,浸泡2次,每次浸泡時間為4 min,然后將肺組織切片進(jìn)行風(fēng)干,并使用中性樹膠進(jìn)行封片。封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液

小鼠處死后浸泡于75%乙醇消毒,在無菌環(huán)境下取出小鼠脾臟并置于篩網(wǎng)中進(jìn)行研磨。研磨后用3 mL PBS沖洗篩網(wǎng),收集至15 mL離心管中,以1 500 r/min、4 ℃離心5 min,去除上清液。用1 mL PBS重懸細(xì)胞,加入紅細(xì)胞裂解液,靜置10 min,充分裂解紅細(xì)胞后以1 500 r/min、4 ℃離心5 min,去除上清液。用1 mL PBS重懸細(xì)胞得到小鼠脾臟單細(xì)胞懸液。

1.6 ELISA法檢測血清中卵清蛋白特異性IgE抗體

小鼠采血后,靜置至凝固,4 000 r/min離心25 min收集上清液,96孔板包被4 ℃過夜,PBST洗板,用5%牛奶封閉,加入血清,加入山羊抗小鼠IgE抗體,37 ℃溫育2 h,PBST洗板,再加入兔抗山羊抗體,37 ℃溫育1 h,PBST洗板,加入TMB顯色液,37 ℃孵育15 min,加入終止液終止反應(yīng),在450 nm波長檢測光密度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中ILC-2、Th17和Treg細(xì)胞

參照文獻(xiàn)[11]方法,對2型天然淋巴細(xì)胞(ILC-2)、Th17和Treg細(xì)胞經(jīng)CD4-FITC、CD45-BV421、GATA3-PE、IL-17-PE、Foxp3-PE染色后,用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞檢測。ILC-2表型為CD4-CD45+GATA3+,Th17細(xì)胞表型為CD4+IL17+,Treg細(xì)胞表型為CD4+CD25+Foxp3+。

1.8 qRT-PCR檢測脾組織中MALAT1及Rorc/Foxp3相對表達(dá)量

提取小鼠脾組織的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照試劑盒說明檢測lncRNA MALAT1及Rorc/Foxp3的表達(dá),用GAPDH對MALAT1、Rorc/Foxp3的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。Rorc和Foxp3購自美國Genecopoeia公司。MALAT1及GAPDH引物由中國擎科生物合成,引物序列如下:MALAT1上游5′-TCCAATCTGCTGCTATTAG-3′,下游5′-CAACAACCACTACTCCAA-3′;GAPDH上游5′-AGCTTGTCATCAACGGGAAG-3′,下游5′-TTTGATGTTAGTGGGGTCTCG-3′。PCR反應(yīng)體系:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,模板2 μL,加水至20 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性30 s,60 ℃退火和延伸10 s,40個循環(huán)。用2-ΔΔCt半定量的方法確定各基因的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵清蛋白成功誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥變化

HE染色結(jié)果顯示,與對照組相比,卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥變化明顯,支氣管周圍存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤,管壁增厚,氣道上皮細(xì)胞破壞或不規(guī)則。PAS染色結(jié)果顯示,與對照組相比,哮喘組的支氣管杯狀細(xì)胞及黏液分泌增多(圖1A)。同時,小鼠脾臟細(xì)胞中ILC-2比例增多(t=8.35,P<0.01),見圖1B。另外,與對照組比較,哮喘組卵清蛋白特異性IgE增高(t=4.17,P<0.05),見圖1C。結(jié)果表明成功建立哮喘小鼠模型。

A:各組小鼠肺組織病理變化(HE染色和PAS染色,×400);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾細(xì)胞中ILC-2比例;C:ELISA法檢測小鼠血清卵清蛋白特異性IgE圖1 小鼠肺組織HE、PAS染色和脾細(xì)胞中ILC-2比例

2.2 哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞比例失調(diào)

與對照組相比,哮喘組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例顯著升高(t=8.08,P<0.01),而Treg細(xì)胞比例顯著下降(t=16.76,P<0.01)。與之相對應(yīng)的是Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rorc表達(dá)上調(diào)(t=3.44,P<0.05),Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)下調(diào)(t=2.32,P<0.05)。見圖2。

2.3 哮喘小鼠脾組織lncRNA MALAT1表達(dá)情況

與對照組相比,哮喘組小鼠脾組織lncRNA MALAT1相對表達(dá)量顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.10,P<0.01)。見圖3。

2.4 哮喘小鼠脾組織lncRNA MALAT1與Th17/Treg細(xì)胞的相關(guān)性分析

隨著小鼠脾組織lncRNA MALAT1表達(dá)增加,Th17細(xì)胞比例上升,呈正相關(guān)(r=0.64,P<0.05),Treg細(xì)胞比例下降,呈負(fù)相關(guān)(r=-0.73,P<0.05)。見圖4。

圖4 lncRNA MALAT1與Th17/Treg細(xì)胞的相關(guān)性

2.5 哮喘小鼠脾組織lncRNA MALAT1與Rorc、Foxp3的相關(guān)性分析

研究結(jié)果表明,隨著小鼠脾組織lncRNA MALAT1表達(dá)增加,Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rorc表達(dá)量也增加,二者呈正相關(guān)(r=0.65,P<0.05);Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)量減少,二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.60,P<0.05),見圖5。

圖5 lncRNA MALAT1與Rorc/Foxp3的相關(guān)性

3 討論

哮喘是兒童和成人常見的疾病,在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出高發(fā)病率和高死亡率[12]。目前哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,以往普遍認(rèn)為哮喘的慢性炎癥是由嗜酸性粒細(xì)胞、ILC-2細(xì)胞、Th2細(xì)胞以及B細(xì)胞共同參與產(chǎn)生[13-14]。ILC-2被認(rèn)為是Th2細(xì)胞對應(yīng)的先天性免疫細(xì)胞,并與Th2細(xì)胞一起在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中起作用,激活的ILC-2s通過快速產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子,如IL-5在黏膜表面引發(fā)過敏性組織炎癥[15-16]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),不僅Th1和Th2細(xì)胞參與哮喘的發(fā)病,Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在哮喘的發(fā)病和進(jìn)展過程中也發(fā)揮了重要的作用。Th17/Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)與哮喘惡化有關(guān),相對于普通哮喘,嚴(yán)重哮喘的IL-17/IL-10和Rorc/Foxp3的比值顯著增加[17]。Th17細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL-17,參與哮喘的病理生理學(xué)過程[18]。Treg細(xì)胞是已知的一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群,能夠抑制其他細(xì)胞的免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)免疫耐受,Treg細(xì)胞的缺失或功能異常會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。本研究通過構(gòu)建哮喘小鼠模型,探討Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、lncRNA MALAT1在哮喘發(fā)病中作用。實驗發(fā)現(xiàn),哮喘小鼠不僅在病理上表現(xiàn)為支氣管周圍出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤、管壁增厚、氣道上皮細(xì)胞破壞或不規(guī)則,而且在免疫上表現(xiàn)為ILC-2/Th17細(xì)胞的比值增加,Treg細(xì)胞比值下降。

lncRNA是炎癥反應(yīng)過程中基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子,是一種高度保守的核非編碼RNA,是肺癌轉(zhuǎn)移發(fā)展的預(yù)測標(biāo)志物,通常以非蛋白轉(zhuǎn)錄物為特征,調(diào)節(jié)多種疾病的病理生理過程[19-20]。Guo等[21]發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT的下調(diào)可促進(jìn)NK細(xì)胞的免疫恢復(fù),促進(jìn)NK-92細(xì)胞中IFN-γ的分泌。近年來已證實lncRNA MALAT1在氣道重塑和氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,上調(diào)的lncRNA MALAT1通過下調(diào)microRNA-216a引起平滑肌細(xì)胞的過度增殖、遷移和侵襲,減少凋亡,提高氣道平滑肌細(xì)胞的活力,而敲除lncRNA MALAT1基因可以抑制氣管平滑肌的增殖和遷移[22-23]。Liang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清中l(wèi)ncRNA MALAT1上調(diào)可以抑制miR-155在CD4+T細(xì)胞內(nèi)表達(dá),減少Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)表達(dá)水平,增加Th2型細(xì)胞因子的分泌,參與調(diào)節(jié)哮喘患者Th1/Th2細(xì)胞平衡。lncRNA MALAT1作為一種新的上皮細(xì)胞來源的免疫調(diào)節(jié)因子,參與特異性的炎癥免疫氣道微環(huán)境,調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞的成熟過程及其促炎因子的分泌[25]。但是lncRNA MALAT1是否參與調(diào)節(jié)哮喘Th17/Treg細(xì)胞的平衡尚未見報道。本研究證實哮喘小鼠脾組織lncRNA MALAT1相對表達(dá)量較對照組增加,與Liang等[24]發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清lncRNA MALAT1上調(diào)一致;哮喘小鼠脾細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)與Th17細(xì)胞比例和Rorc呈正相關(guān),與Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。另外,本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1表達(dá)與Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rorc和Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)關(guān)系密切,lncRNA MALAT1與Rorc呈正相關(guān),與Foxp3呈負(fù)相關(guān)。表明lncRNA MALAT1與哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞失衡密切相關(guān),靶向于lncRNA MALAT1可能有助于改善哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞失衡,但MALAT1調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,哮喘小鼠脾細(xì)胞中ILC-2細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例上升,Treg細(xì)胞比例下降;哮喘小鼠脾細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)增加,并且與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān),與Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān),而且lnc MALAT1的表達(dá)與Rorc的表達(dá)呈正相關(guān),與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此,lncRNA MALAT1可能通過上調(diào)Rorc的表達(dá)或下調(diào)Foxp3的表達(dá)參與調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡,且在哮喘的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。