牛冬冬, 凌亞亭, 呂孝瑞, 王子瑜, 胡嘉波

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所, 浙江 寧波 315042)

人胚胎干細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞(human neural stem cells,hNSCs)是一種多能干細(xì)胞,具有自我更新、多向分化潛力[1]。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞,不僅可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包裹軸突形成髓鞘,還可以通過(guò)旁分泌作用支持保護(hù)神經(jīng)元,抑制神經(jīng)元凋亡[2]。然而臨床上原代的少突膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源受限,難以體外大量擴(kuò)增[3]?；谝浦布?xì)胞在體內(nèi)遷移能力較差且存活率低[4],少突膠質(zhì)細(xì)胞的旁分泌作用成為關(guān)注焦點(diǎn)。神經(jīng)退行性疾病與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[5],人神經(jīng)干細(xì)胞源少突膠質(zhì)樣細(xì)胞條件培養(yǎng)液(oligodendrocytes-like conditioned medium,OCM)成分豐富,可以很好地在體外模擬少突膠質(zhì)樣細(xì)胞(oligodendrocytes-like,OLs)的旁分泌作用。hNSC-OLs可以在體外大量擴(kuò)增,有望成為理想的種子細(xì)胞,為組織工程源源不斷地提供生物材料應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療。本研究旨在探究OLs是否具備體外成髓鞘能力及OCM在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)氧化應(yīng)激損傷中的作用,為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(北京四正柏生物科技有限公司);NSCs由人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化所得[6]。DMEM、DMEM/F12、FBS、Neurobasal培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA(PDGF-AA)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF,美國(guó)PeproTech公司),佛司可林(FSK,上海源葉生物科技有限公司),B27、NEAA(美國(guó)Thermo Fisher公司),基質(zhì)膠(美國(guó)Corning公司),視黃酸(RA)、維生素C(vitamin C,Vc)、Accutase(美國(guó)Sigma公司),青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)Invitrogen公司),CCK-8(美國(guó)APExBIO公司),DAPI、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),兔抗Olig2抗體、兔抗SOX10抗體、鼠抗Tuj抗體(英國(guó)Abcam公司),CyTM3-偶聯(lián)親和純化山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Jackson公司),山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor488二抗(美國(guó)Thermo Fisher公司),活性氧檢測(cè)試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司),乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(南京諾唯贊公司),單克隆兔抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(美國(guó)CST公司),兔抗Bax抗體(英國(guó)Abcam公司),兔抗Bcl-2抗體、兔抗Sirt1抗體、兔抗PGC-1α抗體(美國(guó)Affinity公司),山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(蘇州睿瀛生物技術(shù)公司),Sirt1抑制劑EX527(美國(guó)Selleck公司)。激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司),熒光顯微鏡(日本Olympus公司),多功能酶標(biāo)儀(Cytation5,美國(guó)Biotek公司),超速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM中,細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代。NSCs由人胚胎干細(xì)胞分化得到,培養(yǎng)在含1% NEAA、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2% B27、100 U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的無(wú)血清DMEM/F12中。NSCs匯合度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代。在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞和NSCs。

1.2.2 hNSC-OLs分化 使用P4～P18(第4代至第18代)NSCs進(jìn)行OLs分化,在NSCs匯合度達(dá)60%左右時(shí)棄去原有的培養(yǎng)液,用無(wú)血清DMEM/F12清洗3遍,換成含10% FBS、10 ng/mL PDGF-AA、10 ng/mL NT-3、20 ng/mL bFGF、35 ng/mL RA、5 μmol/L FSK、100 U/mL雙抗的DMEM/F12。首次替換OLs分化培養(yǎng)基的細(xì)胞命名為第0代少突膠質(zhì)樣細(xì)胞(P0-OLs),當(dāng)P0-OLs匯合度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.3 免疫熒光鑒定OLs 6孔板中放置爬片,鋪置基質(zhì)膠,將NSCs和P0-OLs用Accutase消化,終止消化后將NSCs和P0-OLs以5×104/mL的密度鋪置在6孔板中,分別使用NSCs培養(yǎng)液和OLs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后棄去各自的培養(yǎng)液,PBS洗滌1遍,4%多聚甲醛固定5 min,PBS洗滌1遍,0.1% Triton X-100透化5 min,PBS洗滌1遍,1% BSA封閉1 h。1 ∶160稀釋兔抗Olig2抗體,1 ∶200稀釋兔抗SOX10抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。棄去一抗工作液,PBS洗滌1遍,1 ∶200配制CyTM3-偶聯(lián)親和純化山羊抗兔IgG(H+L)二抗,二抗孵育1 h,PBS洗滌4次,每次30 min,加入DAPI染細(xì)胞核,覆蓋住細(xì)胞表面即可,室溫孵育4 min,PBS洗滌3次,每次20 min,封片,激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 hNSCs神經(jīng)元分化 使用P4～P18 NSCs進(jìn)行神經(jīng)元分化,在NSCs匯合度達(dá)40%左右時(shí)棄去原有的培養(yǎng)液,使用Neurobasal培養(yǎng)液清洗3遍,換成補(bǔ)充10 ng/mL BDNF、2% B27、20 ng/mL bFGF、100 U/mL雙抗的Neurobasal培養(yǎng)基,每2～3 d換1次液,2周之后拍照記錄。

1.2.5 OLs與神經(jīng)元共培養(yǎng)及共聚焦顯微鏡檢測(cè)髓鞘形成 在神經(jīng)元分化2周時(shí),將OP1(P0-OLs傳代得到,即第一代少突膠質(zhì)樣細(xì)胞)以5×104/mL密度消化后接種在神經(jīng)元上,使用OLs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),3 d后進(jìn)行免疫熒光染色。1 ∶160稀釋兔抗Olig2抗體,1 ∶2 000稀釋鼠抗Tuj抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。棄去一抗工作液,1 ∶200配制 CyTM3-偶聯(lián)親和純化山羊抗兔IgG(H+L)二抗,1 ∶500配制山羊抗小鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor488二抗,孵育后,激光共聚焦觀察。

1.2.6 OLs條件培養(yǎng)液(OCM)的收集 收集P0-OLs傳代后的1～2代(P1～P2)OCM。當(dāng)OLs細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí),棄去原來(lái)的培養(yǎng)液,用無(wú)血清DMEM輕輕洗滌細(xì)胞5次,再加入無(wú)血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后收集上清液,以2 000 r/min離心20 min沉淀細(xì)胞碎片,隨后將收集的上清液用0.22 μm濾器進(jìn)行過(guò)濾,得到OCM。分裝,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力 將SH-SY5Y細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板中,加入SH-SY5Y細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,正常對(duì)照組(NC組)使用無(wú)血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加藥組設(shè)置50、100、200、400 μmol/L 4個(gè)濃度的H2O2處理細(xì)胞,24 h后吸去原有的培養(yǎng)液,加入100 μL CCK-8工作液,20 min后測(cè)定光密度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用200 μmol/L H2O2處理細(xì)胞。設(shè)置含200 μmol/L H2O2的25%、50%、75%、100%的OCM處理SH-SY5Y細(xì)胞,24 h后同上述方法測(cè)定光密度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用75% OCM處理SH-SY5Y細(xì)胞,即簡(jiǎn)稱(chēng)為H2O2+OCM組。H2O2+Vc組在含200 μmol/L H2O2的DMEM中補(bǔ)充100 μmol/L Vc,作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞處理24 h到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),取上清液,應(yīng)用LDH試劑盒測(cè)定細(xì)胞毒性。光學(xué)顯微鏡觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧 將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL密度接種于6孔板中,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,NC組細(xì)胞處理如“1.2.7”所述,H2O2組替換為含200 μmol/L H2O2的DMEM處理24 h,H2O2+OCM組替換為含200 μmol/L H2O2的75% OCM處理24 h,H2O2+Vc組在含200 μmol/L H2O2的DMEM中補(bǔ)充100 μmol/L Vc處理24 h。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),棄上清液,參照說(shuō)明書(shū)將SH-SY5Y細(xì)胞和DCFH-DA(1 μmol/L)探針避光孵育30 min,陰性對(duì)照組不添加探針,PBS洗滌3次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.9 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)SOD、GSH、MDA含量 將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL密度接種于大皿后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,NC組、H2O2組、H2O2+OCM組、H2O2+Vc組細(xì)胞處理如“1.2.8”所述,棄上清液,PBS洗滌3遍,超聲破碎裂解細(xì)胞,收集離心后測(cè)定蛋白濃度。MDA含量及SOD、GSH活性根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.10 熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位 將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL密度接種于6孔板后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,如“1.2.8”所述,NC組、H2O2組、H2O2+OCM組、H2O2+Vc組細(xì)胞處理12 h。參照說(shuō)明書(shū)配制線粒體膜電位檢測(cè)探針,將不同處理組細(xì)胞與探針37 ℃孵育20 min,棄去探針工作液,加入2 mL完全培養(yǎng)基,熒光顯微鏡觀察。

1.2.11 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于6孔板中,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,NC組、H2O2組、H2O2+OCM組細(xì)胞處理如“1.2.8”所述,棄去各處理組的培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,60 s后加入培養(yǎng)液終止消化,收集細(xì)胞在EP管中,1 000 r/min、4 ℃離心5 min,棄上清液,PBS洗滌2次,加入100 μL緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI熒光探針室溫避光孵育10 min后再加入400 μL緩沖液混勻,置于冰盒中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.12 EX527處理SH-SY5Y細(xì)胞 NC組、H2O2組、H2O2+OCM組細(xì)胞處理如“1.2.7”所述,H2O2+OCM+EX527組,使用20 μmol/L Sirt1特異性抑制劑EX527預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞2 h后,使用含200 μmol/L H2O2的OCM處理24 h;NC+EX527組,使用20 μmol/L Sirt1特異性抑制劑EX527預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞2 h后,使用無(wú)血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.13 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和Sirt1相關(guān)蛋白表達(dá) NC組、H2O2組、H2O2+OCM組、H2O2+OCM+EX527組、NC+EX527組,細(xì)胞處理如“1.2.8”和“1.2.12”所述,實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),棄上清液,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1遍,每孔加入100 μL含1% PMSF的RIPA裂解液,細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞后充分研磨并置于EP管中,冰上裂解1 h,裂解期間每隔15 min劇烈振蕩1次;12 000×g離心10 min,收取上清液測(cè)定蛋白濃度,按照4 ∶1的比例加入上樣緩沖液,混勻,100 ℃金屬浴10 min,-20 ℃保存。等量上樣,行SDS-PAGE,蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,TBST洗滌5 min,5% BSA封閉2 h,TBST清洗2次,每次5 min,將PVDF膜置于一抗工作液中,4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜。使用的一抗包括:兔抗Bax抗體(1 ∶800)、兔抗Bcl-2抗體(1 ∶1 000)、兔抗Sirt1抗體(1 ∶1 000)、兔抗PGC-1α抗體(1 ∶1 000)、抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(1 ∶2 000)。第二天將膜取出,搖床上使用TBST清洗3次,每次10 min,1 ∶1 000稀釋二抗,將膜充分浸泡在對(duì)應(yīng)的二抗中,室溫孵育1 h,TBST清洗3次,每次10 min。ECL顯色系統(tǒng)曝光,觀察條帶并保存圖像,使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSCs分化為OLs

對(duì)比NSCs,OLs凸起明顯變長(zhǎng),細(xì)胞呈紡錘狀,多邊長(zhǎng)梭形,與NSCs玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)有明顯不同(圖1A)。激光共聚焦結(jié)果顯示,OLs表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Olig2和SOX10,而NSCs則幾乎不表達(dá)(圖1B、1C)。

A:NSCs與OLs形態(tài)學(xué)比較;B:少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Olig2激光共聚焦圖;C:少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物SOX10激光共聚焦圖圖1 NSC-OLs的鑒定

2.2 NSC-OLs體外包裹軸突形成髓鞘結(jié)構(gòu)

如圖2A、2B所示,由NSCs定向分化所得的神經(jīng)元軸突細(xì)長(zhǎng),神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1免疫熒光染色陽(yáng)性。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到Olig2紅色標(biāo)記的OLs包裹Tuj1綠色標(biāo)記的神經(jīng)元軸突、NSC-OLs與神經(jīng)元之間的相互作用形成髓鞘樣結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖2C箭頭。

A:人神經(jīng)干細(xì)胞源神經(jīng)元圖;B:神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1免疫熒光染色圖;C:激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)體外OLs包裹神經(jīng)元軸突(白色箭頭處形成髓鞘樣結(jié)構(gòu))圖2 體外觀察NSC-OLs包裹軸突形成髓鞘

2.3 OCM修復(fù)SH-SY5Y細(xì)胞損傷

與NC組比較,200 μmol/L H2O2組SH-SY5Y細(xì)胞存活率大約下降至50%(t=12.670,P<0.01),見(jiàn)圖3A。200 μmol/L H2O2刺激條件下,75% OCM表現(xiàn)出和100% OCM相似的保護(hù)效果,見(jiàn)圖3B。實(shí)驗(yàn)選用Vc作為陽(yáng)性對(duì)照,75% OCM表現(xiàn)出和Vc相似的保護(hù)效果,CCK-8結(jié)果顯示,OCM處理顯著提升了SH-SY5Y細(xì)胞存活率(t=6.923,P<0.01),降低了LDH的釋放(t=11.680,P<0.01),見(jiàn)圖3C、圖3D。

2.4 OCM改善SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激

流式結(jié)果顯示,與NC組相比,H2O2組平均熒光強(qiáng)度顯著升高,而OCM處理顯著降低了熒光強(qiáng)度(t=8.109,P<0.01),提示OCM處理降低了活性氧水平,和Vc處理組效果相似(圖4A)。OCM處理提升了SH-SY5Y細(xì)胞中SOD(t=4.908,P<0.01)、GSH(t=9.679,P<0.01)的活性,降低了MDA含量(t=11.960,P<0.01),見(jiàn)圖4B～4D。此外還使用線粒體膜電位探針(JC-1)檢測(cè)了線粒體膜電位的高低,線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件,在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中,形成聚合物,產(chǎn)生紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體,產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示,H2O2組線粒體膜電位最低,而OCM處理提升了線粒體膜電位,見(jiàn)圖4E。

A:DCFH-DA探針檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞活性氧及定量分析;B～D:化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞SOD、GSH、MDA含量;E:線粒體膜電位檢測(cè)代表性熒光圖像;標(biāo)尺=100 μm圖4 OCM在體外改善了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷

2.5 OCM抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示,與NC組相比,H2O2組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率明顯升高,而OCM處理降低了SH-SY5Y細(xì)胞凋亡(t=13.510,P<0.01),見(jiàn)圖5A。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,與H2O2組相比,OCM處理降低了H2O2誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Bax升高(t=3.226,P<0.05)、抑制了H2O2誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-2降低(t=3.056,P<0.05),見(jiàn)圖5B。

A:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及凋亡細(xì)胞百分比;B:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)及灰度分析圖5 OCM降低了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

2.6 OCM通過(guò)激活Sirt1/PGC-1α通路修復(fù)SH-SY5Y細(xì)胞損傷

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,OCM處理提高了SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt1(t=3.394,P<0.05)、PGC-1α(t=13.920,P<0.01)蛋白表達(dá)水平(圖6A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OCM是否通過(guò)Sirt1/PGC-1α通路改善H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,使用Sirt1特異性抑制劑EX527抑制Sirt1信號(hào)通路的表達(dá)。EX527預(yù)處理后,OCM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用消失,細(xì)胞皺縮,數(shù)量減少(圖6B)。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,EX527預(yù)處理抑制了OCM處理所致的Sirt1(t=3.048,P<0.05)、PGC-1α(t=5.523,P<0.01)升高(圖6C)。結(jié)果提示OCM可以通過(guò)激活Sirt1/PGC-1α通路保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞。

A:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Sirt1、PGC-1α蛋白相對(duì)表達(dá)及灰度分析;B:SH-SY5Y細(xì)胞代表性圖像;C:蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)EX527對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Sirt1、PGC-1α蛋白表達(dá)的影響及灰度分析圖6 OCM通過(guò)激活Sirt1/PGC-1α通路保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞

3 討論

神經(jīng)退行性疾病病因多樣、機(jī)制尚未明確,常致記憶、認(rèn)知功能障礙,神經(jīng)元喪失是其主要的病理特征[7]。相關(guān)研究表明,神經(jīng)退行性疾病發(fā)展過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的自由基,如羥自由基、超氧陰離子、一氧化氮等[8],過(guò)量的自由基未得到及時(shí)清除導(dǎo)致體內(nèi)氧化/抗氧化失衡,過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)神經(jīng)組織造成氧化損傷,最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡甚至壞死[9]。H2O2作為活性氧家族的一員,可以穿過(guò)細(xì)胞膜,產(chǎn)生羥自由基,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。SH-SY5Y細(xì)胞為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,具備一定的神經(jīng)元特征,常被用作理想的體外細(xì)胞模型。因此,本研究使用H2O2刺激SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)模擬氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。

越來(lái)越多的研究表明,NSCs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有積極的支持保護(hù)作用[10]。NSCs是一種具有多向分化潛力的細(xì)胞,葉開(kāi)等[11]發(fā)現(xiàn)NSCs可以分化為外周神經(jīng)系統(tǒng)的施萬(wàn)樣細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)探究NSCs能否分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的OLs且分化所得細(xì)胞是否對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有積極的保護(hù)作用?；谏偻荒z質(zhì)細(xì)胞的支持和營(yíng)養(yǎng)作用,鐘欣等[12]將體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞移植到大鼠腦白質(zhì)部分,發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞可以存活和生長(zhǎng),但是移植細(xì)胞的存活率較低。盡管對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞移植已經(jīng)做了一定的工作,但是移植細(xì)胞不能很好地生長(zhǎng)、存活率低等問(wèn)題仍不能得到很好地解決,因此近年來(lái)少突膠質(zhì)細(xì)胞的旁分泌作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。OCM容易獲得且生物安全性高,能夠很好地模擬細(xì)胞的旁分泌作用,有望成為理想的生物材料。

本研究在體外將NSCs分化為OLs和神經(jīng)元,利用形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫熒光對(duì)OLs進(jìn)行鑒定并在體外觀察其髓鞘形成能力。OLs有望為組織工程提供源源不斷的生物活性材料用于髓鞘缺失類(lèi)疾病的治療。本研究發(fā)現(xiàn),OCM在體外提高了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力,降低了SH-SY5Y細(xì)胞毒性。Vc為常用的抗氧化劑[13],參考鄭金平課題組的實(shí)驗(yàn)方法[14],本研究設(shè)置100 μmol/L的Vc處理組作為陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果顯示OCM處理可以改善SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激,降低細(xì)胞凋亡,提示OCM可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平來(lái)保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免于H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Sirt1是一種組蛋白脫乙酰化酶[15],PGC-1α是Sirt1的去乙酰化底物,二者共同參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)[16]。研究表明,在神經(jīng)退行性疾病患者的血清和大腦中Sirt1含量降低,激活Sirt1有利于神經(jīng)退行性疾病的治療[17]。在線粒體的生物發(fā)生過(guò)程中,PGC-1α被認(rèn)為是核心調(diào)控因子[18],靶向Sirt1信號(hào)通路可以通過(guò)減少PGC-1α的乙?；M(jìn)行能量調(diào)節(jié)從而促進(jìn)線粒體修復(fù)及生物合成,進(jìn)而影響氧化應(yīng)激相關(guān)進(jìn)程[19]。本研究中,OCM處理提升了SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Sirt1、PGC-1α的蛋白表達(dá),為了明確OCM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,使用Sirt1特異性抑制劑EX527預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞,結(jié)果顯示OCM處理所致的Sirt1、PGC-1α蛋白表達(dá)升高被抑制,且OCM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。然而活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞途徑多樣,機(jī)制復(fù)雜,互有交叉,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鐵死亡等[20],有待進(jìn)一步深入探討。

本研究證明了人神經(jīng)干細(xì)胞源OCM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用,為臨床治療神經(jīng)退行性疾病提供了新的治療策略。但OCM的組分復(fù)雜,發(fā)揮保護(hù)作用的具體物質(zhì)仍需進(jìn)一步探索。