王燕青, 楊林, 成春鋒, 陳東風, 冼紹祥, 方紅城

(1. 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管科, 廣東 深圳 518104; 2. 廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院, 廣東 廣州 510006; 3. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科, 廣東 廣州 510405)

硫是一種機體不可缺少的微量元素。機體內(nèi)硫元素主要存在于L-半胱氨酸和L-蛋氨酸這兩種氨基酸中,兩者完全來源于膳食蛋白質(zhì)。其中,半胱氨酸是蛋白質(zhì)中含量最少且高度保守的氨基酸殘基,具有調(diào)節(jié)催化、氧化還原敏感性和金屬離子轉(zhuǎn)運等多種功能[1]。人類蛋白質(zhì)組有214 000個半胱氨酸殘基以硫醇、二硫化物和鋅指的形式存在[2]。在人體細胞質(zhì)內(nèi),最豐富的硫醇形式是谷胱甘肽[3],它參與保護蛋白質(zhì)硫醇免受氧化和交聯(lián)、降解蛋白質(zhì)的二硫鍵等細胞過程[4]。硫醇-二硫化物蛋白質(zhì)組可分為兩組,一組是氧化還原信號硫醇組,在細胞信號傳導中起作用;另一組是氧化還原感應硫醇組,在氧化還原狀態(tài)下起作用[5]。硫醇是活性氧的靶標,其氧化主要產(chǎn)生二硫化物和二硫鍵[6]。細胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵的積累可破壞細胞氧化還原狀態(tài)的平衡,進而誘導雙硫應激和細胞毒性[7]。

2023年2月甘波誼教授團隊[7]在NatureCellBiology雜志首次報道了一種新的細胞死亡方式,即在葡萄糖饑餓狀態(tài)下,NADPH供應不足,癌細胞高表達胱氨酸轉(zhuǎn)運體溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11;也稱為xCT)誘發(fā)二硫化物(如胱氨酸等)在細胞內(nèi)異常積累,導致細胞死亡。因此種細胞死亡方式具有二硫化物應激的特點,故命名為“雙硫死亡”(disulfidptosis)。在該研究中,敲除調(diào)控細胞凋亡與鐵死亡的關(guān)鍵基因后,該種細胞死亡過程仍發(fā)生,但使用硫醇類還原性試劑三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP]可以抑制細胞的死亡。從機制而言,由于葡萄糖饑餓導致NADPH供應不足,細胞將胱氨酸還原為半胱氨酸的過程受阻,肌動蛋白分子間產(chǎn)生大量二硫鍵,誘導雙硫應激,從而激活Rac/WAVE調(diào)節(jié)復合物(WRC)-7亞基肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3(Arp2/3)信號通路造成細胞骨架的紊亂,最終誘導細胞發(fā)生雙硫死亡[7]。目前,關(guān)于雙硫死亡的研究多集中于SLC7A11高表達且處于葡萄糖饑餓狀態(tài)的癌細胞株[8-9]。因此,本文針對硫在機體的代謝、二硫鍵依賴性細胞死亡方式及在腫瘤中的調(diào)控作用作一綜述。

1 硫在機體內(nèi)代謝過程和生理功能

人類和其他動物體內(nèi)所有硫的主要來源為膳食蛋白質(zhì)。與其他營養(yǎng)素一樣,經(jīng)胃腸消化后的硫通過門靜脈循環(huán)直接進入肝臟,肝臟將含硫分子排泄至外周循環(huán)。在人體內(nèi),硫主要存在于半胱氨酸和蛋氨酸這兩種氨基酸中。硫在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)或在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[10]。硫的化學性質(zhì),特別是其可逆地采用多種價態(tài)的能力,是其在許多生物分子中具有獨特功能的基礎(chǔ)[11],這種性質(zhì)允許硫殘基在一些蛋白質(zhì)內(nèi)部或蛋白質(zhì)之間形成可逆的二硫鍵[10]。硫在生物學電子轉(zhuǎn)移渠道中的應用廣泛,密切參與氧化還原反應。因此,硫可能最常用來直接改變細胞內(nèi)氧原子氧化狀態(tài)[10]。在用于蛋白質(zhì)合成的半胱氨酸和蛋氨酸的活性形式中,硫處于完全還原狀態(tài)。硫在半胱氨酸中以硫醇形式存在,在蛋氨酸中以硫醚形式存在。蛋氨酸經(jīng)由機體從食物中獲得的含硫營養(yǎng)素合成,半胱氨酸可以通過轉(zhuǎn)硫途徑由蛋氨酸合成。與蛋氨酸相比,半胱氨酸更易于與過氧化氫反應而具有調(diào)節(jié)氧化還原的特性。同時,半胱氨酸也是細胞中谷胱甘肽、硫化氫和鐵硫簇等生物合成的前體。

半胱氨酸作為組成蛋白質(zhì)或谷胱甘肽結(jié)構(gòu)的一類氨基酸,有助于維持氧化還原穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和細胞間的信號傳導[12]。此外,半胱氨酸作為“代謝樞紐”參與細胞中其他含硫小分子生物合成[13-14]。大多數(shù)半胱氨酸作為氧化還原感應硫醇以響應氧化還原變化。從結(jié)構(gòu)來看,半胱氨酸的功能大多源于其反應性巰基。半胱氨酸在細胞外不穩(wěn)定,易被氧化為胱氨酸[15],同時細胞外半胱氨酸濃度通常較胱氨酸低。因此,大多數(shù)細胞在很大程度上依賴胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白來獲得細胞外胱氨酸,再通過在胞質(zhì)中利用二硫鍵還原生成兩個半胱氨酸分子。半胱氨酸隨后被用于合成谷胱甘肽以及其他生物分子[16]。

硫代謝穩(wěn)態(tài)對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的維持至關(guān)重要。在機體生理活動中,細胞主要以胱氨酸形式從細胞外環(huán)境獲取半胱氨酸,小部分半胱氨酸由蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生。在一些細胞和組織中,從頭生物合成細胞內(nèi)半胱氨酸(其中同型半胱氨酸可以通過轉(zhuǎn)硫途徑轉(zhuǎn)化為半胱氨酸)[17-18]。負責轉(zhuǎn)運胱氨酸的轉(zhuǎn)運蛋白是一種異二聚體,由二硫鍵連接的輕鏈亞基SLC7A11和重鏈亞基溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2,也稱為4F2hc或CD98)組成[19]。SLC3A2是一種單一跨膜蛋白的伴侶,可維持SLC7A11蛋白的穩(wěn)定性和適當?shù)哪ざㄎ?該轉(zhuǎn)運蛋白以1 ∶1的比例輸入細胞外胱氨酸和輸出細胞內(nèi)谷氨酸[20]。半胱氨酸作為硫代謝中主要參與的氨基酸,其在細胞中的合成轉(zhuǎn)化也極其重要。

分泌蛋白或膜蛋白中半胱氨酸的獲得或缺失以及胞質(zhì)蛋白硫醇S-亞硝基化修飾導致硫代謝失調(diào),與色盲[21]、血管性血友病[22]等遺傳性疾病以及帕金森病[23]、阿爾茨海默病[24]等獲得性疾病有關(guān)。

2 雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)及機制

雙硫死亡與凋亡[25]、鐵死亡[26]、焦亡[27]、壞死性凋亡[28]和銅死亡[29]等細胞程序性死亡有不同的誘因和檢測指標(表1)。甘波誼團隊發(fā)現(xiàn)分別敲除鐵死亡蛋白ACSL4和凋亡關(guān)鍵誘導蛋白BAX/BAK并不能逆轉(zhuǎn)細胞死亡,給予細胞活性氧清除劑也不能抑制雙硫死亡[7]。此外,通過透射電子顯微鏡分析SLC7A11高表達細胞死亡并非由于胱氨酸晶體毒性導致[7]。再者,SLC7A11高表達癌細胞ATP水平較對照組升高,排除了細胞死于ATP耗竭的可能性[7]。最終,甘波誼團隊確定該種細胞死亡方式是雙硫死亡。在癌細胞胞質(zhì)中,有害的二硫鍵形成是雙硫死亡的基礎(chǔ),雙硫應激是誘發(fā)雙硫死亡的關(guān)鍵過程。

表1 不同細胞死亡方式的誘發(fā)因素及關(guān)鍵檢測指標

2.1 細胞質(zhì)二硫鍵形成是雙硫死亡的基礎(chǔ)

二硫鍵是通過半胱氨酸或其他物質(zhì)的兩個巰基殘基氧化形成的共價鍵,在蛋白質(zhì)折疊和增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[30]。這種二硫鍵的形成主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜間隙等特殊的隔室中[31],而細胞質(zhì)中的二硫鍵形成是在應激條件下和一些病毒感染的超嗜熱細胞中[32]。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基中的巰基酸度系數(shù)(pKa)>8.0,并且在細胞質(zhì)的還原環(huán)境中和在生理pH下保持質(zhì)子化。因此,細胞質(zhì)蛋白通常不含二硫鍵[33]。當還原性半胱氨酸硫醇遇到活性氧、氮或氯物種時,會形成亞磺酸,繼而迅速與附近的半胱氨酸相互作用,形成分子間或分子內(nèi)二硫鍵[34-35]。細胞質(zhì)中二硫鍵的堆積容易誘發(fā)雙硫應激進而導致雙硫死亡。這種有害的二硫鍵可通過胞質(zhì)硫氧還蛋白系統(tǒng)[硫氧還蛋白還原酶-1(TRXR1)]和谷胱甘肽系統(tǒng)[谷胱甘肽還原酶(GSR)]兩種不同的還原途徑清除[36-37]。這兩種還原途徑以NADPH作為其還原能力的原料控制二硫鍵的形成。因此,在SLC7A11高表達的癌細胞中,切斷葡萄糖供應導致細胞質(zhì)中形成大量的二硫鍵是雙硫死亡的基礎(chǔ)。

2.2 雙硫應激促進細胞雙硫死亡

盡管2023年首次提出“雙硫死亡”的命名,但關(guān)于雙硫應激的相關(guān)研究卻始于更早。硫醇特異性氧化還原系統(tǒng)在保護細胞免受有毒氧的侵害,維持細胞內(nèi)硫醇-二硫化物平衡以及為關(guān)鍵還原酶(如核糖核苷酸還原酶)提供還原能力等方面發(fā)揮著重要作用[38]。H2O2將硫醇氧化為亞磺,然后氧化為亞磺酸或磺酸,并促進亞磺和硫醇之間形成二硫化物;而二酰胺特異性觸發(fā)硫醇之間的二硫化物產(chǎn)生氧化應激,也稱為雙硫應激[39]。近期研究發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)二硫化物(如胱氨酸)的異常積累會誘導二硫化物應激,并對細胞產(chǎn)生高度毒性[8]。在雙硫死亡中,由于細胞內(nèi)大量二硫分子積聚,造成雙硫應激,從而誘導細胞死亡。

3 雙硫死亡與腫瘤的關(guān)系

代謝重編程是癌癥的重要特征之一,它通常導致癌細胞對生物合成和能量代謝中重要營養(yǎng)素的攝取增加,如葡萄糖和谷氨酰胺等[40],主要通過上調(diào)葡萄糖和氨基酸攝取的轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平來實現(xiàn)。相應地,當葡萄糖或氨基酸來源受限時,一些癌細胞會發(fā)生細胞死亡,但正常細胞卻能夠存活。這種營養(yǎng)依賴性為癌癥的靶向治療提供了潛在的代謝脆弱性[41]。甘波誼團隊的研究表明,SLC7A11高表達促進癌細胞代謝脆弱性導致的雙硫死亡可能是治療腫瘤的有效策略[7]。

3.1 SLC7A11高表達促進腫瘤細胞代謝脆弱性導致雙硫死亡

由于癌細胞處于高水平氧化應激狀態(tài)[42],通過從頭合成或蛋白質(zhì)分解代謝提供半胱氨酸通常無法滿足癌細胞對抗氧化防御的高需求,因此癌細胞主要依賴于高表達SLC7A11從細胞外環(huán)境中獲得胱氨酸。此外,高表達SLC7A11可增加抗氧化劑谷胱甘肽的生物合成[41]。多項研究表明,在胱氨酸充足狀態(tài)下,SLC7A11高表達的癌細胞通過攝取胞外胱氨酸,促進谷胱甘肽合成從而抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積,最終抑制細胞鐵死亡促進腫瘤生長[43-45]。相反,將細胞培養(yǎng)基中胱氨酸去除或通過基因消融或藥物抑制使SLC7A11失活可在多種癌細胞中誘導強有力的細胞死亡[43,46]。由此可知,應激誘導的SLC7A11高表達可通過抑制癌細胞鐵死亡促進腫瘤生長[47]。

根據(jù)上述結(jié)論,研究人員最初假設(shè)SLC7A11高表達可能保護細胞免受葡萄糖饑餓引發(fā)的死亡。令人驚訝的是,研究結(jié)果表明,SLC7A11過表達顯著促進葡萄糖饑餓誘導的細胞死亡,而SLC7A11失活顯著抑制葡萄糖饑餓下的細胞死亡[48-49]。甘波誼教授團隊探究其機制發(fā)現(xiàn),葡萄糖可通過磷酸戊糖途徑提供NADPH以還原有毒的胱氨酸[8]。在葡萄糖饑餓條件下,給予細胞補充2-脫氧葡萄糖以提供NADPH可以顯著阻止SLC7A11高表達癌細胞雙硫死亡和氧化還原缺陷[8]。因此,癌細胞SLC7A11高表達增強自身對葡萄糖的依賴性[50],并使癌細胞對葡萄糖缺乏誘導的雙硫死亡更敏感。同時,SLC7A11過表達也增強癌細胞對谷氨酰胺的依賴性。谷氨酰胺是一種重要氨基酸,參與細胞能量和生物合成過程,并維持癌細胞的氧化還原平衡[51]。SLC7A11高表達促進谷氨酸輸出,導致細胞內(nèi)谷氨酸的部分耗竭,然后通過解除反饋抑制并激活谷氨酰胺酶驅(qū)動細胞攝取更多的谷氨酰胺以補充谷氨酸。Timmerman等[52]研究表明,乳腺癌基底細胞和claudin-low三陰性乳腺癌細胞對谷氨酰胺缺乏的敏感性與SLC7A11表達水平和胱氨酸消耗率相關(guān),此研究支持SLC7A11高表達癌細胞對谷氨酰胺依賴這一觀點。

雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)顛覆了SLC7A11高表達促進腫瘤生長這一傳統(tǒng)觀點,即SLC7A11在促進雙硫死亡過程中起著重要作用。SLC7A11在癌細胞中的高表達在降低細胞發(fā)生鐵死亡風險的同時,又增加細胞發(fā)生雙硫死亡的風險,它在調(diào)節(jié)癌細胞的氧化還原平衡和營養(yǎng)依賴性方面起著雙刃劍的作用[41]。另外,谷胱甘肽生物合成減少是細胞發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵因素,同時也在雙硫死亡中發(fā)生。由此推斷,由于SLC7A11和谷胱甘肽的共同參與,雙硫死亡與鐵死亡間存在相關(guān)串擾,具體機制見圖1。

:上升;:下降;:中斷;SLC7A11:溶質(zhì)載體家族7成員11;NADP+:氧化型輔酶Ⅱ;NADPH:還原型輔酶Ⅱ;GPX4:谷胱甘肽過氧化物酶4圖1 SLC7A11高表達癌細胞中鐵死亡與雙硫死亡機制示意圖

3.2 靶向雙硫死亡及SLC7A11/SLC7A11相關(guān)代謝脆弱性的癌癥治療策略

多項研究表明,SLC7A11是多種癌細胞系中葡萄糖缺乏導致細胞死亡的關(guān)鍵決定因素[48-49,53]。SLC7A11在惡性膠質(zhì)母細胞瘤[53]、腎細胞癌[54]、肺癌[55]、肝癌[56]和胰腺癌[57]等癌癥中呈高表達,其高表達通常與患者預后不良相關(guān)。研究表明,Slc7a11敲除鼠是可存活的,Slc7a11敲除在主要器官中未出現(xiàn)明顯的表型[58]。因此,SLC7A11有望成為癌癥治療中一個有前景的治療靶點。

既往研究多聚焦于直接抑制SLC7A11轉(zhuǎn)運體活性誘導癌細胞死亡。目前,Erastin、Erastin咪唑酮衍生物、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼和HG106已被鑒定或表征為SLC7A11抑制劑[59-60]。然而,由于Erastin代謝穩(wěn)定性差和在體內(nèi)溶解度低,其不能用于動物研究[59];Erastin咪唑酮衍生物可用于動物實驗[61],但未進入臨床試驗階段;雖然索拉非尼和柳氮磺胺吡啶已經(jīng)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準,但索拉非尼在腫瘤治療中作為多激酶抑制劑發(fā)揮抗癌作用,而柳氮磺胺吡啶可以阻止前列腺素合成,均不能確認二者在任何特定環(huán)境下的抗癌作用確實是由SLC7A11抑制和鐵死亡誘導引起的;盡管HG106最近被鑒定為SLC7A11抑制劑[60],但其具體機制還有待進一步研究?？傊?盡管臨床前研究已確定抑制SLC7A11活性的治療策略,但仍需進一步確定有效且特異的SLC7A11抑制劑,研究其作用機制,進行臨床試驗,并最終應用于臨床。

最近,研究人員提出靶向癌癥中SLC7A11相關(guān)代謝脆弱性(葡萄糖或谷氨酰胺依賴性)誘導雙硫死亡來制定癌癥的治療策略[19]。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn),與SLC7A11低表達癌細胞相比,葡萄糖轉(zhuǎn)運體(glucose transporter,GLUT)抑制劑更容易誘導SLC7A11高表達癌細胞發(fā)生雙硫死亡。在細胞系異種移植物和肺癌患者來源的異種移植物中使用KL-11743(強效的泛GLUT1和GLUT3抑制劑),可以選擇性地抑制SLC7A11高表達腫瘤生長[44]。與此同時,SLC7A11高表達癌細胞也表現(xiàn)出谷氨酰胺依賴性。出現(xiàn)Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1,KEAP1)基因突變的癌癥表現(xiàn)為核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)過度激活和SLC7A11高表達[62]。與KEAP1野生型細胞系相比,谷氨酰胺酶抑制劑CB-839對KEAP1突變細胞系或患者來源的異種移植物腫瘤生長的抑制作用更強[63-64]。此外,SLC7A11高表達可作為生物標志,用于選擇癌癥患者進行谷氨酰胺酶或GLUT抑制劑治療。雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)有望針對癌癥代謝的弱點,為癌癥的代謝治療提供一種新的途徑。

然而,并非所有腫瘤都呈SLC7A11高表達,一些腫瘤(如ARID1A缺陷型腫瘤或具有p53功能獲得突變的腫瘤)甚至呈SLC7A11低表達[65-66]。值得注意的是,甘波誼團隊在葡萄糖饑餓條件下,向SLC7A11低表達的人腎透明細胞腺癌786-O細胞的培養(yǎng)基中添加額外的胱氨酸可耗盡細胞內(nèi)NADPH,誘導肌動蛋白細胞骨架蛋白中的二硫鍵形成和F-肌動蛋白收縮,并引發(fā)細胞死亡[7]。由此可見,SLC7A11低表達細胞誘導雙硫死亡相關(guān)機制仍需要深入研究,同時,非癌細胞中是否發(fā)生雙硫死亡也有待進一步研究。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,硫、含硫的半胱氨酸及硫醇有助于維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。細胞氧化還原狀態(tài)失衡時,胞質(zhì)內(nèi)硫醇氧化易形成有害的二硫鍵。細胞質(zhì)中的二硫鍵在NADPH供應不足時無法被清除,繼而誘發(fā)雙硫應激導致雙硫死亡。

已證明SLC7A11高表達可抑制癌細胞鐵死亡。雙硫死亡是一種在葡萄糖饑餓的狀態(tài)下,由SLC7A11高表達的癌細胞胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵大量生成誘導雙硫應激介導的硫依賴性細胞死亡,這一新發(fā)現(xiàn)表明鐵死亡與雙硫死亡之間有一定的相關(guān)性。因此,后續(xù)有必要研究通過干擾SLC7A11促進鐵死亡的治療是否也會抑制雙硫死亡的發(fā)生;同時,研究如何在癌癥的靶向治療中避免該現(xiàn)象。