石 旺，楊 冰，陳帥虎，何雅媛，何 浩

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南長沙 410007）

近年來，因食品假冒偽劣、真?zhèn)坞y辨而產(chǎn)生的食品安全問題越來越多[1-2]。食品真?zhèn)蔚臋z測技術(shù)包括基于核酸檢測、蛋白分析檢測和質(zhì)譜檢測等手段[3-4]，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是核酸檢測技術(shù)中常用的方法，該方法是以DNA或者RNA分子為模板在體外進(jìn)行擴增檢測的技術(shù)，是一種脫離活體進(jìn)行微量/痕量分析的技術(shù)[5]。PCR技術(shù)始于20世紀(jì)80年代，具有檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點，已衍生出巢式PCR、測序PCR、實時熒光PCR、數(shù)字PCR以及PCR芯片等技術(shù)。其中實時熒光PCR能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR的擴增過程，在生物學(xué)、食品、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-7]。

目前，針對轉(zhuǎn)基因成分及動物源性成分主要采用實時熒光PCR檢測方式[8]。為確保實時熒光PCR技術(shù)檢測結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，許多領(lǐng)域頒布了相關(guān)指南，如2009年首個國際化標(biāo)準(zhǔn)指南——MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）[9]發(fā)布，該標(biāo)準(zhǔn)為實時熒光PCR技術(shù)提供了思想指導(dǎo)，為其他應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[10]。根據(jù)每年參加能力驗證的報告和文獻(xiàn)報道可知，對于食品領(lǐng)域動物源性成分的檢測合格率幾乎達(dá)不到100%滿意[11-12]。國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會發(fā)布了《基因擴增檢測方法確認(rèn)與驗證指南》（RB/T 032—2020），該標(biāo)準(zhǔn)旨在幫助實驗室提高基因擴增檢驗水平，要求對實驗室引入的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進(jìn)行驗證。

本研究依據(jù)《肉及肉制品中動物源性成分的測定 實時熒光PCR法》（SB/T 10923—2012）和《基因擴增檢測方法確認(rèn)與驗證指南》（RB/T 032—2020），對豬源性成分進(jìn)行引物擴增效率、檢出限和基質(zhì)等參數(shù)研究，輔以能力驗證結(jié)果確認(rèn)驗證效果，以期為同行在開展基因擴增活動時進(jìn)行方法驗證提供參考，提升檢驗質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬源性（QC-AN-003）、鴨源性（QC-AN-007），中國檢科院質(zhì)控樣品；3116A、3116B，F(xiàn)APAS能力驗證樣品編號。

DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0），批號AL52397A，Takara生物；實時熒光PCR反應(yīng)試劑盒（PerfectStart?Ⅱ Probe qPCR SuperMix），批號O20818，北京全式金生物。

1.2 引物及探針序列

豬源性成分Porcine：引物及探針購自上海生工，序列信息見《常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法》（SB/T 10923—2012）；內(nèi)參18S rRNA：引物及探針購自上海生工，序列信息見《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》（BJS 201707）。

1.3 儀器與設(shè)備

LightCycler 480II羅氏實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；Infinite 200 PRO TECAN多功能酶標(biāo)儀（瑞士迪肯公司）；3H16RI智能高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.4 實驗方法

根據(jù)SB/T 10923—2012和實驗組織方提供的作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行樣品檢測。

1.4.1 基因組DNA的提取

采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書進(jìn)行樣品基因組DNA（genomic DNA，gDNA）提取。

1.4.2 熒光定量PCR檢測

依據(jù)SB/T 10923—2012中檢測豬源性成分檢測方法，PCR擴增體系見表1。擴增條件：50 ℃保溫2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，45個循環(huán)，每個循環(huán)收集熒光信號。

表1 PCR擴增體系（20 μL）

1.4.3 檢驗設(shè)置

陽性對照：豬成分gDNA；陰性對照：鴨成分gDNA；空白對照：ddH2O。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證

根據(jù)RB/T 032—2020要求，對定性方法進(jìn)行驗證需要對檢出限、基質(zhì)效應(yīng)、重復(fù)性進(jìn)行驗證，因此本文通過檢測擴增效率、檢出限和基質(zhì)參數(shù)方面，對豬源性成分進(jìn)行分析。

2.1.1 Porcine引物擴增效率及檢出限

實時熒光PCR擴增過程中添加不同量的豬源性gDNA，擴增結(jié)果的Ct值見表2。從表2中可以看出，隨著豬源性gDNA的減少，其Porcine檢測的Ct值逐漸增大，當(dāng)擴增量為0.1 ng時，Ct值接近于30；18S rRNA的Ct值也隨著gDNA的減少而逐漸變大。Porcine的檢出限可以達(dá)到0.1 ng。

表2 PCR擴增效率

根據(jù)擴增效率MIQE標(biāo)準(zhǔn)E=10-1/k-1[9,12-13]（E代表擴增效率，k代表斜率），理想狀態(tài)下，log gDNA量與Ct值存在一定的線性關(guān)系，即Y=-kX+B，X代表log gDNA量，Y代表Ct值，k代表斜率。根據(jù)表2中的Ct值和gDNA量對數(shù)作線性分析，結(jié)果見圖1。

圖1 Ct值與log gDNA線性關(guān)系

從圖1可知，Porcine：Y=-3.395 9X+25.583，R2=0.998 5，其k=-3.395 9；18S rRNA：Y=-3.497 1X+24.97，R2=0.998 5，其k=-3.497 1。由此可得出Porcine擴增效率E=97%，18S rRNA擴增效率E=93%。表明本實驗中豬源性引物擴增效率符合要求，且log gDNA與Ct值的相關(guān)系數(shù)為0.998 5。

2.1.2 不同基質(zhì)影響

擴增體系加入6.0 ng gDNA，每組gDNA分別由不同量豬源性gDNA和鴨源性gDNA組成，PCR擴增結(jié)果見表3。在有其他基質(zhì)干擾的情況下，分析豬源性引物擴增的Ct值與豬源性DNA對數(shù)的線性關(guān)系見圖2?？梢钥闯觯砑硬煌科渌|(zhì)的PCR體系中，Porcine擴增曲線Y=-3.552 8X+26.27，R2=0.998 6，其k=-3.552 8，由此得出此時擴增效率E=91%；Porcine引物在有其他基質(zhì)影響的情況下，其擴增效率受到了一定影響，但仍然大于90%，因此也非常理想。對于內(nèi)參18S rRNA，由于有兩種類型基質(zhì)都可以發(fā)生擴增，但不同類型基質(zhì)情況不一致，所以不便分析其線性關(guān)系。

圖2 不同基質(zhì)下豬源性log gDNA與Ct值線性關(guān)系

表3 不同基質(zhì)的影響

2.2 FAPAS檢測結(jié)果

按照SB/T 10923—2012對FAPAS能力驗證樣品3116A和3116B中的豬源性成分進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表4和圖3。根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)（Ct值≤35.0，且有典型的擴增曲線，則判定該樣品含有相應(yīng)的動物源性成分；Ct值＞35.0，或無典型的擴增曲線，則判定該樣品不含相應(yīng)的動物源性成分），樣品3116A檢測結(jié)果豬成分Ct值大于35.0，且無典型的擴增曲線，判定為不含豬源性成分；樣品3116B檢測結(jié)果豬成分Ct值小于35.0，且有典型的擴增曲線，判定為含有豬源性成分。

圖3 能力驗證樣品擴增曲線

表4 FAPAS樣品檢測結(jié)果

3 討論

內(nèi)參基因又稱為管家基因，用來衡量樣品間的濃度和純度差異性，可以減少實驗誤差，確保實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確[13]。SB/T 10923—2012標(biāo)準(zhǔn)中沒有內(nèi)參要求，但基于內(nèi)參的重要性，本研究增加了內(nèi)參數(shù)據(jù)。在不同基質(zhì)影響參數(shù)中，每個熒光定量PCR體系里面的DNA總量相等，但內(nèi)參18S rRNA引物擴增出來的Ct值有一定差異，并且隨著兩者的混合比例發(fā)生變化，這可能與不同物種之間18S rRNA量存在差異有關(guān)[14]。在進(jìn)行擴增效率的驗證時，本研究的樣品是質(zhì)控樣，還可以采用含序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行實驗[15]。

4 結(jié)論

本實驗根據(jù)RB/T 032—2020對豬源性成分定性檢測方法進(jìn)行試驗，通過驗證該基因擴增引物的檢出限、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)參數(shù)，最終證實本實驗室滿足SB/T 10923—2012的要求。同時根據(jù)驗證結(jié)果對FAPAS能力驗證樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果符合要求。