蔡丹陽 李潔 李運倫

來自全球疾病負(fù)擔(dān)的數(shù)據(jù)顯示,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致殘率、致死率較高的疾病之一[1]。冠狀動脈疾病會導(dǎo)致冠狀動脈血流受限或缺血癥狀,是CVD最常見的形式。由于及時的再灌注醫(yī)療策略,如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting,CABG),可同時促進(jìn)心肌梗死邊緣區(qū)血流量的恢復(fù)和挽救瀕死的心肌細(xì)胞,在過去幾十年中CVD死亡率有所降低。但在此過程中往往會引起心肌的二次損傷,即心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注損傷有多種機制,包括線粒體自噬、線粒體Ca2+超載、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成、血小板活化、微血栓形成等,其中線粒體自噬是新近研究熱點。研究證實益氣活血類中藥能增強或減弱線粒體自噬從而防治缺血性心臟病。本文就近年來采用益氣活血法調(diào)控線粒體自噬防治缺血性心臟病的相關(guān)研究進(jìn)行歸納總結(jié),以期為益氣活血法防治心肌缺血再灌注損傷的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 線粒體自噬途徑及其在心肌缺血再灌注損傷中的作用

Lemasters[2]于2005年首次提出“線粒體自噬”概念。研究表明,線粒體功能障礙是導(dǎo)致缺血性心臟病發(fā)生的主要原因。線粒體自噬可以清除功能異常的線粒體和用新的線粒體代替之間取得良好的平衡,最大程度保護(hù)心肌細(xì)胞。線粒體自噬缺陷可導(dǎo)致動物心臟退行性疾病并改變線粒體自噬通量,這也被證明會影響一些心血管疾病的預(yù)后,如心肌梗死、各種類型的心肌病和動脈粥樣硬化等。在哺乳動物細(xì)胞中,有多條信號通路被證實參與介導(dǎo)線粒體自噬的過程,目前介導(dǎo)線粒體自噬的調(diào)節(jié)機制主要包括誘導(dǎo)同源性磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1(PINK1-Parkin)、BCL2 相互作用蛋白3(BCL2 interacting protein 3,BNIP3)/NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X,NIX)(BNIP3/NIX),以及FUNDC1 (FUN 14 domain containing protain 1)等[3-5],見圖1。

圖1 線粒體自噬途徑及其在心肌缺血再灌注損傷中的作用

1.1 PINK1-Parkin途徑

PINK1-Parkin途徑是線粒體自噬最經(jīng)典的方式之一。在健康的線粒體中,PINK1位于線粒體外膜,可利用氨基末端的線粒體靶向序列,在轉(zhuǎn)位酶的帶動下到達(dá)內(nèi)膜進(jìn)行降解。整個過程中,PINK1可以持續(xù)不斷地監(jiān)測線粒體不同時期的健康狀態(tài),并在線粒體功能受到阻礙時,快速發(fā)出信號[6]。當(dāng)線粒體受損,線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondral permeablity transition pore,mPTP)的去極化,導(dǎo)致PINK1在線粒體外膜處積聚,將部分泛素磷酸化,并促進(jìn)Parkin向線粒體外膜募集和激活。激活后的Parkin可以泛素化電壓依賴性陰離子通道(voltagedependent anion-selective channel 1,VDAC1)、線粒體融合蛋白(mito-fasion 1,MFN1)/MFN2等,泛素化的MFN2通過蛋白酶體降解,導(dǎo)致線粒體分裂,同時泛素化的VDAC1會募集自噬受體OPTN,進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體自噬[7-8]。而當(dāng)PINK1-Parkin和其他線粒體自噬相關(guān)基因發(fā)生突變時,就會導(dǎo)致線粒體自噬功能障礙,進(jìn)一步導(dǎo)致受損線粒體的積累、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)元死亡[9-10]。

當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生時,線粒體膜電位上升導(dǎo)致線粒體Parkin蛋白加速轉(zhuǎn)運,線粒體自噬被激活。Siddall等[11]采用缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)敲除Pink1基因的小鼠,心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)雜亂無章,梗死面積顯著增加,同時ROS誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化也更敏感。另一項關(guān)于Parkin1基因敲除研究中發(fā)現(xiàn),實驗組相較于對照組線粒體紊亂更為顯著,在缺血再灌注中心肌損傷面積更大、小鼠生存率更低[12]。因此,PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬,通過清除受損線粒體在心肌中的累積,減少心臟梗死面積,治療缺血性心臟病。

1.2 BNIP3/NIX途徑

BNIP3和NIX是一種同源蛋白,均定位于線粒體,具有相同LIR基序,可與LIR結(jié)合作為自噬受體,直接與自噬體上的LC3結(jié)合,其中BNIP3與LC3的結(jié)合需要其同二聚體化,進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。但是,在線粒體自噬過程中BNIP3和NIX的表現(xiàn)略有不同,BNIP3在缺氧期間調(diào)節(jié)線粒體自噬,BNIP3的功能涉及相反的兩方面:一方面是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死,起到促進(jìn)死亡的作用;另一方面,引起自噬或線粒體自噬,起到促存活作用,而NIX調(diào)節(jié)紅細(xì)胞譜系成熟時線粒體的自噬過程[13-17]。當(dāng)細(xì)胞處于惡劣的環(huán)境下,BNIP3可誘導(dǎo)過度線粒體自噬,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而NIX并不能誘導(dǎo)過度的線粒體自噬[18-19]。

BNIP3/NIX介導(dǎo)的線粒體自噬主要作用于缺血性心臟病早期。缺血再灌注時,心肌細(xì)胞處于嚴(yán)重缺血、缺氧的狀態(tài),活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)的大量生成,ROS生成后,快速激活BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬并清除功能異常的線粒體,同時利用此過程分解得到的氨基酸和脂肪酸,來幫助細(xì)胞渡過缺血缺氧導(dǎo)致的能量耗竭,恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[20-21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在SD大鼠缺血再灌注早期,BNIP3表達(dá)量會隨著缺血再灌注時間點的升高而升高,缺血缺氧的狀態(tài)也隨之不斷變少[22]。因此,通過BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬可有效清除損傷的線粒體,對ROS的大量釋放及細(xì)胞死亡通路的激活有重要作用。

1.3 FUNDC1途徑

FUNDC1是由中國科學(xué)院動物研究所陳佺研究員課題組發(fā)現(xiàn)的,通過啟用線粒體自身的蛋白酶系統(tǒng)或線粒體自噬機制幫助細(xì)胞維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[23-24]。健康狀態(tài)下,FUNDC1被第13位絲氨酸的激酶(casein kinase 2,CK2)和第18位酪氨酸的激酶(src family kinase,Src)磷酸化,處于磷酸化狀態(tài)下的FUNDC1與LC3相互作用不明顯。而在心肌缺血缺氧狀態(tài)下,PGAM5脫磷磷酸化FUNDC1,去磷酸化的 FUNDC1和LC3相互作用增強,從而第一時間激發(fā)線粒體自噬[25-27]。

迄今為止,大多數(shù)研究證實FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬在心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn) Mst1在缺血再灌注后顯著上調(diào),并且Mst1通過抑制RK-CREB信號通路和抑制FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬,防止心肌缺血再灌注發(fā)生[28]。另有研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注后,Ripk3明顯上調(diào),從而抑制FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬,因此,FUNDC1通路的調(diào)控,可能是心臟再灌注損傷中心臟保護(hù)的一種新策略[29]。以上結(jié)果提示,適當(dāng)促進(jìn)再灌注時期,心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬,有利于心肌保護(hù)。

2 益氣活血類中藥干預(yù)線粒體自噬治療心肌缺血再灌注

研究表明,中藥單體、組分、復(fù)方都可以通過調(diào)節(jié)不同通路或受體蛋白介導(dǎo)線粒體自噬,保護(hù)缺血再灌注損傷。通過研究益氣活血類中藥的有效成分、藥理作用及分子機制,最大限度發(fā)揮靶向調(diào)節(jié)作用,是研究缺血性心臟病的重要研究方向之一。

2.1 干預(yù)PINK1-Parkin信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬

黃芪甲苷是黃芪皂苷中主要活性成分之一。在缺血性心臟病中可防止心肌纖維化,提高心肌收縮能力,保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血、缺氧的損傷[30-31]。李旭陽等[32]通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型,結(jié)果表明,黃芪甲苷通過作用于PINK1-Parkin途徑,可明顯降低心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST),抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善線粒體自噬,治療缺血性心臟病。張東偉等[33]實驗同樣在大鼠缺血再灌注模型中檢測生化指標(biāo)CK-MB、總膽固醇(cholesterol,CHOL),結(jié)果表明黃芪甲苷對缺血再灌注損傷的心肌的保護(hù)作用可能與降低炎癥反應(yīng)、抑制PINK1-Parkin 通路介導(dǎo)的線粒體過度自噬相關(guān)。除此之外,黃芪甲苷還可基于PINK1-Parkin通路,減少自噬體聚集,改善線粒體功能,抑制自噬蛋白如LC3II及P62的表達(dá),保護(hù)心肌細(xì)胞,防止缺血再灌注損傷。

三七總皂苷是中藥三七中極重要的活性成分之一。在心肌缺血缺氧狀態(tài)下,三七總皂苷可顯著增強ATP酶活性成分,加速線粒體生成與轉(zhuǎn)化,減少因線粒體受損引起的的缺血、缺氧、細(xì)胞損傷,調(diào)節(jié)線粒自噬。楊子平等[34-35]實驗表明,三七總皂苷能降低再灌注損傷中血清心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH和CK的含量,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量產(chǎn)生與累積,通過抑制線粒體自噬PINK1-Parkin通路,影響線粒體自噬結(jié)合和裂解,進(jìn)而保護(hù)心臟。三七總皂苷防止缺血再灌注損傷文獻(xiàn)中少有涉及,目前研究表明,三七總皂苷主要通過自噬通路PINK1-Parkin,抑制心肌纖維化,緩解氧化應(yīng)激,治療缺血性心臟病。

加味丹參飲在缺血性心臟病中,具有減少炎癥因子,降低心肌線粒體腫脹,改善線粒體功能,調(diào)節(jié)自噬等作用[36-37]。楊艷紅等[38]發(fā)現(xiàn),加味丹參飲可明顯升高模型組Parkin蛋白的表達(dá),使冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所改變。因此,加味丹參飲在線粒體自噬過程中,嚴(yán)格把控線粒體質(zhì)量和數(shù)量,并通過PINK1-Parkin通路激活線粒體自噬,減輕缺血再灌注損傷。在治療缺血性心臟病中,不僅遵守了益氣活血的治療準(zhǔn)則,其有效成分在后期的調(diào)養(yǎng)中也發(fā)揮著必不可少的作用。

益脈顆粒具有補氣、活血、滋陰等功效。由于其重要的抗心律失常、抗血栓,減輕心肌炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、改善心肌缺血缺氧等功能,被廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療當(dāng)中[39-40]。張東偉[41]的研究發(fā)現(xiàn),益脈顆粒給藥后,線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、P62表達(dá)量明顯降低,并通過PINK1-Parkin的調(diào)節(jié),促進(jìn)線粒體融合、分裂,維持線粒體動態(tài)平衡,進(jìn)而減輕大鼠缺血再灌注心肌損傷。綜上,經(jīng)益脈顆粒干預(yù)后,大鼠心肌纖維排列整齊,其有效成分可改善心肌組織間的水腫,減少炎性細(xì)胞。因此,益脈顆?？赏ㄟ^PINK1-Parkin通路保護(hù)心肌,治療缺血性心臟病。

益氣活血方是在補陽還五湯的基礎(chǔ)上研制而成,由益氣藥和活血藥組成。羅晨曦[42]研究發(fā)現(xiàn),LC3I、LC3II、PINK1、Parkin、P62分別作為自噬標(biāo)志物,在缺血再灌注損傷中,益氣活血方可明顯增加PINK1、Parkin、P62蛋白與抑制LC3II/LC3I自噬蛋白的表達(dá),因此推測益氣活血方通過PINK1-Parkin途徑,抑制線粒體過度自噬,維持線粒體質(zhì)量與數(shù)量,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)功能,改善線粒體腫脹與結(jié)構(gòu)的破裂,進(jìn)而治療缺血性心臟病。

通心絡(luò)膠囊在缺血性心臟病中發(fā)揮著不可替代的作用,它可以通過上調(diào)AMPK蛋白表達(dá),抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[43]。YANG等[44]采用大鼠缺血再灌注損傷模型,經(jīng)檢測自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、p62、Beclin1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),通心絡(luò)可以通過PINK1-Parkin線粒體自噬通路,與泛素蛋白酶一同清除損傷的線粒體,維持胞內(nèi)平衡,進(jìn)而治療缺血性心臟病。除此之外,通心絡(luò)膠囊可以增加血管彈性,降低炎癥因子的釋放,有利于治療缺血性心臟病。

2.2 干預(yù)BNIP3/NIX信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬

三七總皂苷作為常用的治療心血管疾病的天然產(chǎn)物成分[45],研究發(fā)現(xiàn),通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支,構(gòu)建SD大鼠缺血再灌注模型, 給藥三七總皂苷預(yù)處理7天,心肌組織中大量的HIF-1α、BNIP3 和 Beclin1被激活,血清中CK-MB、LDH等炎癥標(biāo)志物降低,自噬蛋白LC3II/LC3I表達(dá)升高,心肌組織線粒體損傷減弱。因此,三七總皂苷可以通過激活BNIP3/NIX途徑,降低炎癥因子表達(dá),增強線粒體自噬, 有效防止缺血再灌注損傷。

丹酚酸B是一種酚類化合物,對缺血性心肌具有保護(hù)作用[46]。實驗結(jié)果表明,通過缺氧4小時復(fù)氧2小時,構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞模型,通過給藥丹酚酸B,可降低LC3-II/LC3-I比值及促凋亡蛋白(NIP3-like protein X,NIX)表達(dá)水平,并升高線粒體膜電位[47]。辛高杰等[48]的一項研究同樣表明,丹酚酸B能夠保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞中缺血再灌注損傷, 增加線粒體膜電位,削弱caspase-3和LC3II的蛋白表達(dá),同時增加細(xì)胞活性。因此,丹酚酸B通過促凋亡,減少心肌缺血、缺氧,對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機制均與NIX介導(dǎo)的線粒體自噬密切相關(guān)。

2.3 干預(yù)FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬

雙參寧心膠囊主要包括人參總皂苷、延胡索生物堿和丹參總酚酸。雙參寧心膠囊可以益氣、化瘀、改善心臟凝血功能,減輕缺血缺氧狀態(tài)下的心肌損傷,維持穩(wěn)定的線粒體功能,保護(hù)心臟[49]。辛高杰等[50-51]采用大鼠缺血再灌注損傷模型,通過檢測血清中損傷標(biāo)志物CK、LDH、CK-MB明顯升高,Western blot 實驗中FUNDC1蛋白表達(dá)增高,表明缺血再灌注損傷時FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬被激活。因此,雙參寧心膠囊可通過FUNDC1通路抑制線粒體自噬,防止缺血性心臟病的發(fā)生。具體詳見表1。

表1 益氣活血類中藥單體及復(fù)方調(diào)控線粒體自噬治療缺血性心臟病

本實驗室也針對FUNDC1信號通路做了相關(guān)研究,通過構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷小鼠模型,從調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬的角度,研究人參皂苷RG1與三七皂苷R1組分對模型小鼠的抗心肌再灌注損傷作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RG1-R1組分藥改善了心肌缺血再灌注損傷小鼠的心功能,逆轉(zhuǎn)了心肌缺血再灌注損傷小鼠心臟的心肌病理變化;其次,電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)RG1-R1組分藥能促進(jìn) FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬,干預(yù)心肌缺血再灌注損傷,且其調(diào)控 FUNDC1 介導(dǎo)的線粒體自噬的機體機制可能與CK2α通路密切相關(guān)。

3 小結(jié)

線粒體是心肌細(xì)胞能量的主要源泉,參與調(diào)控細(xì)胞凋亡與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞處于缺血、缺氧環(huán)境中,受損線粒體會發(fā)生選擇性、有序性自噬降解,以維持心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和某些細(xì)胞器的更新。線粒體自噬作為機體的一種選擇性降解機制,在心肌細(xì)胞中發(fā)揮了雙刃劍作用。過度激活線粒體自噬會導(dǎo)致線粒體大量丟失,線粒體自噬不足會導(dǎo)致線粒體堆積,引發(fā)心肌的功能障礙。只有適當(dāng)調(diào)控線粒體自噬機制,及時清除受損線粒體,維持線粒體質(zhì)量與體內(nèi)能量供應(yīng),防止損傷后的炎癥反應(yīng)和纖維化等,才能改善心功能,減輕心肌缺血再灌注損傷。線粒體自噬防治缺血再灌注損傷主要通過PINK1-Parkin、FUNDC1、BNIP3L/NIX等信號通路啟動,不同途徑間存在相互聯(lián)系和影響。

中醫(yī)藥治療缺血性心臟病具有全面性、靈活性、 毒副作用小、 藥源豐富等特色和優(yōu)勢。綜上,益氣活血類中藥單體(丹參酮IIA、三七皂苷、人參皂苷、丹酚酸B、黃芪甲苷等)及中藥復(fù)方(益氣活血方、雙參寧心膠囊等)可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬途徑,發(fā)揮防止線粒體腫脹與結(jié)構(gòu)的破裂,降低炎癥因子,抑制心肌細(xì)胞凋亡等作用,進(jìn)而治療缺血性心臟病(見表1)。除此之外,益氣活血類中藥可能具有其他有益作用,包括調(diào)控代謝、抗炎和抗氧化等。

如何使線粒體自噬最大程度的發(fā)揮保護(hù)心肌缺血、缺氧的作用,還需進(jìn)一步研究探索。目前益氣活血類中藥改善缺血再灌注損傷仍處于初級階段,動物模型參差不齊,統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)不夠完善,臨床實驗證據(jù)不足,除經(jīng)典通路和蛋白外其他機制涉及不多等諸多問題。雖然益氣活血類中藥單體及復(fù)方在一定程度被證明有效,但仍沒有發(fā)揮出最大潛力。益氣活血類中藥是否比已知的自噬調(diào)節(jié)劑如HDAC抑制劑、二甲雙胍、環(huán)孢素和mTOR抑制劑更具優(yōu)勢尚不清楚,但這篇綜述有助于闡明新型自噬調(diào)節(jié)劑的設(shè)計,從而為未來治療缺血性心臟病的線粒體自噬精細(xì)控制指明方向。