鐵巖 李瀟 楊鑫偉 劉浩龍 許利平

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常見并發(fā)癥之一,臨床上主要通過控制血糖、改善神經(jīng)微循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等措施來防治DPN,但是西藥治療效果有限、成本較高且易發(fā)生藥物依賴,DPN的治療仍存在局限性[1]。中醫(yī)認(rèn)為DPN屬于肢痹、脈痹、痹證、痿證等范疇,治療在分型論治基礎(chǔ)上多加用化瘀通絡(luò)之品[2]。因雞血藤具有良好的活血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)功效,常用于治療DPN[3],但其作用于DPN的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究尚不清楚。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)雞血藤治療DPN的活性成分及作用機(jī)制,采用UPLC-MS/MS測(cè)定雞血藤水煎液化學(xué)成分,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究雞血藤藥效物質(zhì)對(duì)DPN中雪旺細(xì)胞(schwann cell,SCs)可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 雞血藤活性成分及疾病靶點(diǎn)收集與篩選 通過數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://lsp.nwu.wdu.cn/tcmsp.php)中查找雞血藤化合物信息,以口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18篩選雞血藤活性化合物。使用TCMSP、Symmap(http://www.symmap.org/)、pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物進(jìn)行DPN靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。在GeneCards(http://www.genecards.org/)、 OMIM(http://omim.org/)和DrugBank (https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diabetic peripheral neuropathy”為關(guān)鍵詞檢索DPN相關(guān)靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)在uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范。

1.1.2 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將雞血藤活性成分靶點(diǎn)與DPN相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析,交集靶點(diǎn)即為雞血藤治療DPN的潛在靶點(diǎn),將其提交至String11.0數(shù)據(jù)庫(kù),得到PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化,計(jì)算各靶點(diǎn)度值。將排名前5的靶點(diǎn)作為雞血藤作用于DPN的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.1.3 通路與功能富集分析 基于Metascape平臺(tái)對(duì)雞血藤治療DPN的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析,篩選排名靠前的生物過程和通路并對(duì)結(jié)果可視化。

1.1.4 雞血藤成分—DPN靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 使用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建雞血藤成分—DPN靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖,利用該軟件內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)參數(shù),包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等,根據(jù)Degree選取度值排名前10的化合物作為雞血藤治療DPN的關(guān)鍵化合物。

1.1.5 分子對(duì)接 在TCMSP、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得雞血藤治療DPN的關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu),在Auto Dock Tools中進(jìn)行去水、加氫操作,保存為pdbqt格式;在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),于Pymol軟件中進(jìn)行去溶劑、去配體,并在Auto Dock Tools中進(jìn)行加電荷等操作,使用Auto Dock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 主要試劑與儀器 雞血藤飲片(購(gòu)自北京同仁堂藥店,經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)副教授羅容鑒定為正品);芒柄花黃素(formononetin,FMNT)(485-72-3,上海源葉生物有限公司);乙腈(AH015,Honeywell);雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)RSC96細(xì)胞系(CRL-2765,ATCC);胎牛血清(C0230,Bovogen);DMEM高糖培養(yǎng)基(C11965500BT,gibco);細(xì)胞用雙抗(PB180120,普諾賽);細(xì)胞用DMSO(D2650,Sigma)。

CCK8試劑盒(C6005,新賽美);Tunel試劑盒(A112-02,Vazyme);4%多聚甲醛(BL539A,biosharp);白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)抗體(ab9324,abcam);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)抗體(ab205587,abcam);核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)抗體(100745-1-AP,proteintech);磷酸化NF κB抗體(ab76302,abcam);信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抗體(10253-2-AP,proteintech);磷酸化STAT3抗體(9145T,CST);β-actin抗體(ab826,abcam);熒光二抗(ab150081,abcam)。

UPLC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Q Exactive HF,Thermo);冷凍干燥儀(alpha2-4,CHRIST公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(310,Thermo公司);酶標(biāo)儀(Spectramax iD,melecular公司);熒光顯微鏡(TE2000,nikon);化學(xué)發(fā)光&凝膠成像系統(tǒng)(Fusion Fx6 XT 型,Vilber Lourmat 公司);高內(nèi)涵篩選分析儀(Cellomics ArrayScan VTI 600,Thermo)。

1.2.2 雞血藤水煎液化學(xué)成分鑒定 取適量雞血藤飲片以10倍水浸泡30分鐘后,煎煮兩次,每次1小時(shí),合并水煎液冷凍干燥成粉末。分別精密稱定雞血藤粉末及FMNT對(duì)照品配制成溶液,使用UPLC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)、Agilent C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)進(jìn)行雞血藤水提物化學(xué)成分分析。

色譜條件:流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),洗脫梯度為:0～1分鐘,95%A;1～3分鐘,95%～70%A;3～11分鐘,70%～35%A;11～14分鐘,35%～15%A;進(jìn)樣量1 μL;流速0.3 mL/分鐘;柱溫25 ℃。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離(electrospray ionization,ESI),正離子模式(噴霧電壓3.8 kV),負(fù)離子模式(噴霧電壓-3.1 kV);毛細(xì)管溫度320 ℃;鞘氣流速45 arb;輔助氣流速15 L/分鐘;全掃描和二級(jí)掃描模式;質(zhì)譜掃描范圍m/z 200～1200。

1.2.3 雪旺細(xì)胞(Schwann cell,SCs)培養(yǎng)及分組 SCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。分為以下五組:空白對(duì)照組(25 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS),高糖模型組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS),FMNT高劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+100 nM FMNT),FMNT中劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+10 nM FMNT),FMNT低劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+1 nM FMNT)。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)定 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。將SCs接種于96孔板中按組別對(duì)應(yīng)條件培養(yǎng)48小時(shí)后,每孔加入10 μL CCK8溶液孵育并測(cè)定450 nm處吸光度。細(xì)胞活力=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組)/(OD空白組-OD對(duì)照組)×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將SCs接種于24孔板中按條件培養(yǎng)48小時(shí),獲得細(xì)胞爬片。用4%多聚甲醛固定,0.1% TritonX-100透化細(xì)胞,滴加TUNEL反應(yīng)液于37 ℃避光孵育2小時(shí)。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞,每組隨機(jī)選擇3個(gè)視野,記錄凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn) 參考Yang等[4]方法,將SCs接種于96孔板中培養(yǎng)48小時(shí)后,棄去培養(yǎng)基,使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,0.1%TritonX-100透化細(xì)胞后使用3%BSA封閉。棄去封閉液,分別加入100 μL的IL-6(1∶100)和TNF-α(1∶100)一抗于4℃條件下孵育過夜。使用對(duì)應(yīng)熒光二抗(1∶200)于室溫下孵育1小時(shí),DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。高內(nèi)涵分析儀獲取目標(biāo)蛋白熒光圖片及熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Western Blot實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞按條件培養(yǎng)后吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌后加入RIPA裂解液,獲得細(xì)胞蛋白質(zhì)。使用BCA法對(duì)總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,加入上樣緩沖液煮沸變性,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后,加入一抗于4 ℃下孵育過夜。使用的一抗有:NFκB(1∶2000)、p-NFκB(1∶1000)、Bcl2(1∶2000)、STAT 3(1∶2000)、p-STAT 3(1∶2000)、β-actin(1∶2000)。加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶20000)室溫孵育1小時(shí),TBST洗膜后加ECL發(fā)光液曝光,保存掃描結(jié)果。應(yīng)用Image J軟件獲取條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤活性成分的獲取

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出包括兒茶素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇等化合物共24個(gè)化合物,見表1。

2.2 雞血藤—DPN交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI network)及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得雞血藤活性成分相關(guān)靶點(diǎn)150個(gè),DPN相關(guān)靶點(diǎn)1533個(gè),二者靶點(diǎn)經(jīng)Venn分析后得到59個(gè)交集靶點(diǎn)(見圖1A)。將59個(gè)交集靶點(diǎn)提交至String11.0平臺(tái)并用Cytoscape3.7.1對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,結(jié)果顯示網(wǎng)絡(luò)涉及52個(gè)節(jié)點(diǎn),404條邊。使用內(nèi)置功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小反映連接度(degree)大小,即與節(jié)點(diǎn)相連的邊越多,連接度值越大,節(jié)點(diǎn)也就越大(見圖1B)。選取度值排名前五的靶點(diǎn),即IL-6、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1,認(rèn)為是雞血藤作用于DPN的關(guān)鍵靶點(diǎn),其主要參數(shù)見表2。

注:A:雞血藤—DPN靶點(diǎn)韋恩圖;B:交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.3 交集靶點(diǎn)GO注釋與KEGG通路富集分析結(jié)果

GO注釋分析結(jié)果得到生物學(xué)過程1686條、分子功能93條、細(xì)胞組分81條共1860條信息。結(jié)果表明(見圖2A),雞血藤主要參與生物學(xué)過程包括對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)等,主要發(fā)揮的分子功能是細(xì)胞因子結(jié)合、蛋白激酶活性等,主要影響的細(xì)胞組分是膜筏、胞漿外區(qū)域等。

注:A:GO富集分析;B:KEGG通路富集分析。

KEGG通路富集分析表明交集靶點(diǎn)顯著富集的通路有糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗通路等(見圖2B)。

2.4 雞血藤活性成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建活性成分—靶點(diǎn)—通路圖,通過內(nèi)置插件分析雞血藤治療DPN網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù),認(rèn)為雞血藤發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物是木犀草素、芒柄花黃素、甘草查兒酮A、維斯體素、 β-谷固醇等,見圖3、表3。

圖3 雞血藤活性成分—靶點(diǎn)—通路—DPN網(wǎng)絡(luò)圖

表3 雞血藤治療DPN的關(guān)鍵活性化合物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

將表2所得關(guān)鍵靶點(diǎn)和表3關(guān)鍵活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為結(jié)合自由能<-5.0 Kcal/mol二者結(jié)合能力較高,結(jié)合自由能<-7.0 Kcal/mol二者結(jié)合能力高,可見雞血藤關(guān)鍵活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合(見圖4)。

注:A:關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合自由能;B:FMNT化學(xué)結(jié)構(gòu);C:FMNT與(1)IL-6(2)AKT1(3)MAPK1(4)STAT3結(jié)合模擬圖。

2.6 雞血藤水煎液化學(xué)成分鑒定

雞血藤水煎液成分正離子圖譜見圖5,經(jīng)與對(duì)照品及文獻(xiàn)[5-6]比對(duì),鑒定了以下9個(gè)化合物(見表4)。

圖5 雞血藤水煎液譜圖

表4 雞血藤水煎液UPLC-MS/MS分析

2.7 芒柄花黃素對(duì)高糖環(huán)境下SCs活性的影響

CCK8結(jié)果表明,高糖組細(xì)胞活性比空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01),經(jīng)不同濃度FMNT治療后,FMNT中低劑量組SCs活性比高糖組有明顯提高(P<0.01)。見表5。

表5 FMNT對(duì)SCs細(xì)胞活力的影響

2.8 FMNT對(duì)高糖環(huán)境下SCs凋亡的影響

TUNEL結(jié)果表明,高糖處理后SCs中呈綠色的凋亡細(xì)胞比例增加,而經(jīng)過FMNT處理后,凋亡細(xì)胞比例降低,表明FMNT可以減少高糖引起的SCs凋亡。發(fā)揮抗凋亡作用的Bcl2經(jīng)高糖處理后表達(dá)明顯降低(P<0.01),給與FMNT后可以逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。進(jìn)一步證實(shí)FMNT可以減少高糖引起的SCs凋亡。見圖6～7,表6～7。

圖6 各組SCs的TUNEL染色

圖7 各組SCs的Bcl2的表達(dá)

表6 FMNT對(duì)SCs凋亡的影響

表7 FMNT對(duì)SCs的Bcl2表達(dá)的影響

2.9 FMNT對(duì)高糖環(huán)境下SCs中IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

由于SCs并不能像炎癥細(xì)胞一樣能夠產(chǎn)生大量的炎性因子,ELISA法難以測(cè)出低于常規(guī)檢出限的炎性因子,因此采取高內(nèi)涵法測(cè)定IL-6和TNF-α的水平。結(jié)果表明,高糖環(huán)境下的SCs中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平升高,說明高糖環(huán)境下SCs發(fā)生了炎癥反應(yīng)[與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05)],而經(jīng)過 FMNT的處理后,二者的表達(dá)水平顯著降低[與高糖組比較,FMNT中低劑量組作用明顯(P<0.05,P<0.01)],表明 FMNT可以抑制高糖環(huán)境下SCs的炎癥反應(yīng)。見圖8、表8。

表8 FMNT對(duì)SCs的IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

2.10 FMNT對(duì)高糖環(huán)境下SCs中STAT3-NF κB信號(hào)通路的影響

Western Blot法測(cè)定經(jīng)典炎癥通路NF κB及其磷酸化蛋白表達(dá)和上游磷酸化STAT3表達(dá)水平,驗(yàn)證FMNT對(duì)高糖環(huán)境下SCs的的影響。與空白對(duì)照組相比,高糖組p-NF κB/NF κB表達(dá)顯著增加(P<0.05),p-STAT3表達(dá)明顯增加(P<0.05);與高糖組相比,FMNT高、低劑量組p-NF κB/NF κB表達(dá)降低(P<0.05),FMNT中低劑量組p-STAT3表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖9～10,表9。

圖9 各組SCs的p-NF κB/NF κB的表達(dá)

圖10 各組SCs的p-STAT3的表達(dá)

表9 FMNT對(duì)SCs中STAT3-NF κB信號(hào)通路的影響

3 討論

DPN作為糖尿病常見并發(fā)癥,具有高致死率、高致殘率的特點(diǎn),尋求高效低毒的藥物一直是研究的熱點(diǎn)[1]。雞血藤具有良好的補(bǔ)血活血功效,臨床常用于治療DPN。中藥具有多成分—多靶點(diǎn)—多途徑共同調(diào)節(jié)的特點(diǎn),本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方和分子對(duì)接技術(shù)篩選雞血藤治療DPN的主要活性成分及潛在靶點(diǎn),試圖探討其治療DPN的可能機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果表明,雞血藤治療DPN的核心化合物可能是木犀草素、FMNT、甘草查兒酮A、維斯體素、 β-谷固醇。有研究認(rèn)為,木犀草素具有抗氧化作用,通過降低活性氧和丙二醛水平、增加神經(jīng)中Nrf2表達(dá),減輕糖尿病大鼠的感覺異常增加神經(jīng)傳導(dǎo)速度[7];β-谷固醇通過改善胰島素分泌、抑制α-葡萄糖苷酶、降糖和抗氧化作用從而改善DPN大鼠的感覺異常,起到神經(jīng)保護(hù)的作用[8];FMNT可以有效降低DPN大鼠血糖,降低胰島素抵抗,通過增加坐骨神經(jīng)組織中SIRT1和NGF表達(dá)提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度,減少坐骨神經(jīng)組織的氧化應(yīng)激[9]。由此可見,雞血藤中不同類型化合物均對(duì)DPN有一定的效果,但是雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜,何種物質(zhì)主要發(fā)揮作用并不明晰。因此相較于針對(duì)雞血藤化學(xué)成分研究,本研究更關(guān)注常用的水煎液成分。使用UPLC-MS/MS系統(tǒng)對(duì)雞血藤水煎液化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明其主要化合物為黃酮類及其苷類,如FMNT及芒柄花苷。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及文獻(xiàn)報(bào)道,本研究選擇FMNT作為雞血藤治療DPN的關(guān)鍵化合物開展作用機(jī)理驗(yàn)證。

DPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)基因及信號(hào)通路,包括神經(jīng)炎癥、晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積等[10],而周圍神經(jīng)系統(tǒng)中形成神經(jīng)軸突髓鞘的SCs因其能夠在神經(jīng)修復(fù)和再生中起到關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是DPN的主要靶點(diǎn)[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明,雞血藤通過影響糖尿病的晚期糖基化終末產(chǎn)物通路作用于IL-6、STAT3、AKT、MAPK1、JUN等靶點(diǎn)從而起到治療DPN的作用,分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)證實(shí)FMNT與以上靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合。文獻(xiàn)研究表明,長(zhǎng)期高血糖會(huì)使葡萄糖與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)的產(chǎn)物不斷堆積生成不可逆的糖基化產(chǎn)物,即AGEs,堆積在周圍神經(jīng)表面,與細(xì)胞表面的受體,如RAGEs結(jié)合,引起下游一系列有害信號(hào)級(jí)聯(lián),包括預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中IL-6、STAT3涉及的炎癥相關(guān)通路,如NF κB信號(hào)通路[12],以及AKT、JUN涉及的凋亡相關(guān)通路[13],最終造成SCs凋亡。IL-6是NF κB下游的炎癥指標(biāo),其表達(dá)水平在DPN患者體內(nèi)顯著升高[14]。當(dāng)周圍神經(jīng)損傷時(shí),損傷部位近端軸突觀察到磷酸化的STAT3,存在STAT3-IL-6信號(hào)軸將免疫反應(yīng)從SCs傳遞到感覺神經(jīng)元[15];此外,在高糖環(huán)境下的SCs中也觀察到磷酸化STAT3表達(dá)升高[16]。因此本研究對(duì)糖尿病中AGE-RAGEs信號(hào)通路的下游炎癥相關(guān)通路即STAT3-NF κB通路進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在本研究中,采用DPN細(xì)胞模型—高糖環(huán)境下SCs,探討雞血藤中主要化合物FMNT的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖環(huán)境增加了SCs的炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá),增加p-NF κB表達(dá)量,雖未影響非磷酸化的STAT3表達(dá)量,但顯著提高了p-STAT3水平,意味著STAT3-NF κB炎癥通路被激活,導(dǎo)致SCs細(xì)胞活力降低,凋亡增加。而經(jīng)FMNT處理后,逆轉(zhuǎn)了高糖帶來的不利影響,增加高糖環(huán)境下SCs的細(xì)胞活力,減少了SCs凋亡,說明FMNT可以保護(hù)高糖環(huán)境下的SCs,這與抑制STAT3-NF κB通路減少炎癥因子有關(guān)。

雞血藤作為臨床常用于治療DPN的藥物,其療效顯著,但其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制并不明晰。通過本研究對(duì)雞血藤水煎液進(jìn)行了化學(xué)成分鑒定,并運(yùn)用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,建立了“化合物—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò),對(duì)雞血藤作用于DPN的作用機(jī)制進(jìn)行了探究。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從理論層面預(yù)測(cè)雞血藤的作用機(jī)制較為寬泛且針對(duì)性不強(qiáng),本研究只對(duì)STAT3-NF κB信號(hào)進(jìn)行了初步驗(yàn)證,但該通路是否是治療DPN的主要通路?通過通路的阻斷或基因敲高或敲低將能更加明晰其作用機(jī)制。其他作用機(jī)制是否也參與發(fā)揮作用,尚需進(jìn)一步深入研究。