宋紀(jì)顯 陳琦 楊新櫟 安繼仁 趙亞碩 吉恩生

阻塞性呼吸睡眠暫停(obstructive sleep apnea,OSA)可引起慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),誘導(dǎo)小鼠心肌損傷和心臟功能障礙[1]。CIH主要的病理特征是反復(fù)低氧/復(fù)氧循環(huán),引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[2-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種心血管疾病密切相關(guān),持續(xù)高水平存在會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng),造成細(xì)胞功能障礙和凋亡[4]。本課題組前期研究證實(shí)半夏厚樸湯可通過(guò)減少鐵沉積,抑制氧化應(yīng)激和線粒體損傷,進(jìn)而減輕CIH引起的心臟損傷[5-6],同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)CIH可以激活ERS導(dǎo)致主動(dòng)脈血管重構(gòu)[7],但是半夏厚樸湯是否可以通過(guò)抑制ERS反應(yīng)發(fā)揮心臟保護(hù)作用尚不明確。因此為了進(jìn)一步探討CIH引起心臟損傷的具體機(jī)制以及尋找半夏厚樸湯發(fā)揮心臟保護(hù)作用的其他潛在機(jī)制,課題組建立小鼠CIH模型,并觀察ERS在其中的作用以及半夏厚樸湯對(duì)ERS的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6N小鼠(SPF級(jí),雄性),8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào): SYXK[冀]2017-005,于河北中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)河北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查(動(dòng)物倫理編號(hào):DWLL2020044)。

1.2 主要藥品與試劑

半夏厚樸湯所用中藥飲片均購(gòu)自河北神威藥業(yè)有限公司,處方:半夏12 g、厚樸9 g、茯苓12 g、生姜15 g、蘇葉6 g。

RIPA裂解液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號(hào):G2002)、蛋白酶抑制劑(Thermo Scientific,貨號(hào):A32955)、Tween-20(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):9005-64-5)、BCA試劑盒(CoWin Biosciences,貨號(hào):CW0014),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒(南京建成,貨號(hào):A001-1、A007-1、A003-1)、TUNEL試劑盒(Vazyme Biotech,貨號(hào):A112)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號(hào):GB11098)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)抗體(華安生物,貨號(hào):ET17030)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原1樣蛋白(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein, ERO1L)抗體(Bioss公司,貨號(hào):bs-10551R)、GAPDH抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號(hào):GB15002)。

1.3 儀器設(shè)備

CIH氧艙(Oxyeycler Model 84,BioSpherix公司,美國(guó))、小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(Vevo 2100, VisualSonics,加拿大)、生化分析儀(Phenom Pro,荷蘭)、多功能讀數(shù)儀(Varioskan LUX,Thermo Scientific,美國(guó))、多功能成像系統(tǒng)(Vilber Fusion FX5 Spectra,Vilber Lourmat,法國(guó))。

1.4 造模與分組

將C57BL/6N小鼠30只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:正常組、模型組(CIH組)、半夏厚樸湯治療組(簡(jiǎn)稱治療組)。模型制備共計(jì)3周,具體方法參考本課題組前期研究[5]。每日造模前,治療組小鼠灌胃給予半夏厚樸湯0.3 mL[7.02 g/(kg·d),此處參照漢代張仲景的《金匱要略》中的配方,按照臨床成人(70 kg)劑量的等效小鼠(20 g)劑量換算,即0.14 g/20 g],模型組與正常組小鼠灌服與治療組同等體積的生理鹽水。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 超聲心動(dòng)圖分析 造模結(jié)束前一天,進(jìn)行小動(dòng)物B超檢測(cè)。首先將小鼠放入麻醉盒中,沖入異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉,麻醉成功后將小鼠固定在操作板上,小鼠鼻腔持續(xù)給予異氟烷,并用脫毛膏將小鼠心區(qū)附近脫毛,暴露胸腔,將耦合劑擠在心區(qū),用探頭檢測(cè)相關(guān)的指標(biāo)。然后以QRS波和T波作為收縮期和舒張期的指標(biāo),結(jié)合圖像上二尖瓣的開(kāi)閉情況測(cè)量左心室內(nèi)徑。M型超聲記錄并測(cè)定射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LV-End systolic diameter,LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LV-End diastolic diameter,LVEDD)。所有測(cè)試小鼠至少取3個(gè)連續(xù)循環(huán)的平均值,并進(jìn)行分析。

1.5.2 動(dòng)物標(biāo)本采集 造模結(jié)束后,采用0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,首先進(jìn)行摘除眼球法取血,留存用于血清指標(biāo)的檢測(cè)。然后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作板上,暴露胸腔。迅速摘取心臟用4°C生理鹽水沖洗,放于無(wú)菌無(wú)酶凍存管內(nèi),置于液氮、-80°C保存,用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.3 心肌酶檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定各組小鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶同工酶1(lactic dehydrogenase isoenzyme1, LDH1)的含量。每組小鼠隨機(jī)抽取6只進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 心臟組織中ROS檢測(cè) 取小鼠心臟組織,加入RIPA裂解液,3000 轉(zhuǎn)離心10分鐘,取上清液加入待測(cè)試劑,置于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)550 nm處,分別測(cè)定SOD、CAT活力和MDA含量。每組小鼠隨機(jī)抽取3只進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5 Western blot檢測(cè) 稱取小鼠心肌組織,按照組織重量∶裂解液=10 mg∶100 μL的比例加入預(yù)冷的RIPA裂解液,將組織剪碎后用研磨儀研磨1分鐘/次,共三次,然后用高速冷凍離心機(jī)4°C、12000 轉(zhuǎn)離心20分鐘,吸取上清液。用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,選取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用脫脂奶粉常溫封閉2小時(shí)后孵育GAPDH、GRP78、CHOP、ERO1L一抗4°C過(guò)夜,然后用TBST洗滌3次,每次15分鐘,常溫孵育山羊抗小鼠/兔二抗2小時(shí)后用TBST洗滌3次,每次15分鐘,用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。用Image J軟件對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行分析,計(jì)算目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH灰度值的相對(duì)表達(dá)。每組小鼠隨機(jī)抽取3只進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.6 TUNEL染色 每組小鼠取3只制備冰凍切片。將冰凍切片固定后,使用蛋白酶K修復(fù)。之后滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20分鐘,然后滴加buffer常溫孵育10分鐘進(jìn)行室溫平衡。滴加反應(yīng)液,37℃恒溫箱孵育2小時(shí)后滴加DAPI染液,避光室溫孵育10分鐘,復(fù)染細(xì)胞核。將切片洗滌甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像以檢測(cè)凋亡小體的數(shù)量,代表心肌細(xì)胞凋亡的情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 半夏厚樸湯對(duì)CIH暴露小鼠心臟功能的影響

超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明,與正常組相比,模型組小鼠左心室EF下降(P<0.05),LVESD、LVEDD均有不同程度的升高(P<0.05);與模型組相比,治療組小鼠EF提高,LVESD、LVEDD均有下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖

表1 各組小鼠心臟功能指標(biāo)EF、LVESD、LVEDD比較

2.2 半夏厚樸湯對(duì)CIH暴露小鼠血清CK、CK-MB、LDH1含量的影響

與正常組相比,模型組CK、CK-MB、LDH1的含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,治療組的CK、CK-MB、LDH1含量明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中CK、CK-MB、LDH1的含量比較

2.3 半夏厚樸湯能對(duì)CIH暴露小鼠心臟組織SOD、MDA、CAT含量的影響

與正常組相比,模型組SOD和CAT含量明顯降低,MDA含量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,治療組SOD、CAT含量上升,MDA含量下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠心臟組織中SOD、MDA、CAT的含量比較

2.4 半夏厚樸湯對(duì)CIH暴露小鼠心臟組織GRP78、CHOP、ERO1L蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明,與正常組相比,模型組GRP78、ERO1L、CHOP的蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,治療組GRP78、ERO1L、CHOP的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

圖2 各組小鼠心臟組織中GRP78、ERO1L、CHOP蛋白表達(dá)情況

表4 各組小鼠心臟組織中GRP78、ERO1L、CHOP蛋白表達(dá)水平比較

2.5 半夏厚樸湯對(duì)CIH暴露小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組心肌細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)量明顯增多;與模型組相比,半夏厚樸湯治療組心肌細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)量出現(xiàn)下降。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠心臟組織TUNEL染色(×400,鼠只=3)

3 討論

OSA作為一種慢性進(jìn)行性疾病,其最主要的病理特征是CIH,能夠引起氧化應(yīng)激和ERS水平升高,日久會(huì)導(dǎo)致包括心血管疾病在內(nèi)的多種并發(fā)癥,所以在早期進(jìn)行干預(yù)十分必要[7-9]。大多數(shù)OSA患者表現(xiàn)為形體肥胖,痰、氣是其主要的病理因素,貫穿整個(gè)發(fā)病過(guò)程[10],而半夏厚樸湯重在行氣降逆化痰[11],與OSA的病機(jī)基本相符。

本課題組前期研究證實(shí),CIH過(guò)程中反復(fù)的低氧—復(fù)氧循環(huán)可以通過(guò)加重鐵沉積導(dǎo)致氧化應(yīng)激,進(jìn)而造成心肌線粒體損傷和心功能障礙,而半夏厚樸湯處理可以降低氧化應(yīng)激損傷從而改善心功能[5-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在對(duì)缺血—再灌注損傷的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮核心作用,而CIH的缺氧/復(fù)氧變化類似于缺血—再灌注[12]。同時(shí)有研究證實(shí),CIH也可以造成大鼠ERS水平的升高[13]。目前對(duì)于ERS在OSA病理生理反應(yīng)中的作用研究較少,且半夏厚樸湯是否能通過(guò)降低ERS反應(yīng)改善CIH導(dǎo)致的心臟損傷尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探討半夏厚樸湯發(fā)揮預(yù)防心臟損傷的具體機(jī)制,進(jìn)一步研究半夏厚樸湯與ERS反應(yīng)之間的調(diào)控關(guān)系。

ERS參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,包括缺血性心臟病、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等[14]。有研究顯示,大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)心肌ERS可顯著激活,而ERS預(yù)處理可以減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[15-16]。當(dāng)細(xì)胞受到缺血、缺氧的刺激時(shí),未折疊蛋白和錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累,觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)稱為ERS[17]。長(zhǎng)期的ERS可造成促凋亡蛋白GRP78、CHOP升高,通過(guò)ERO1L-肌醇1,4,5-三磷酸受體途徑觸發(fā)鈣依賴性ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的功能障礙[18-19]。本研究結(jié)果顯示,半夏厚樸湯處理3周后,小鼠心功能明顯改善,心肌酶水平下降,心肌細(xì)胞凋亡情況減輕,說(shuō)明半夏厚樸湯可以改善CIH引起的小鼠心臟損傷。后續(xù)結(jié)果表明,CIH暴露可以導(dǎo)致ERS關(guān)鍵蛋白GRP78、CHOP、ERO1L的表達(dá)明顯上升,ERS水平升高,而半夏厚樸湯可以下調(diào)這些蛋白的表達(dá),這說(shuō)明半夏厚樸湯可能是通過(guò)抑制ERS發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

綜上所述,半夏厚樸湯可以改善CIH暴露引起的小鼠心功能障礙,其作用機(jī)制可能與抑制ERS反應(yīng)、減輕細(xì)胞凋亡有關(guān),這為半夏厚樸湯治療OSA引起的心臟損傷提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和治療思路。