申慧貞 趙騫 閆慧敏 楊燕 王昕泰 劉暢

功能性便秘(functional constipation,FC)是兒科門診常見的消化系統(tǒng)疾病,長期便秘可引起食欲減退、口苦口臭、腹脹腹痛等胃腸功能紊亂,病程越長,干預(yù)越晚,治療效果越差[1]。升降潤腸方由北京兒童醫(yī)院已故名醫(yī)王鵬飛治療便秘經(jīng)驗方加減而成[2],本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方治療兒童FC療效顯著[3],但其作用機(jī)制尚不清楚。FC與胃腸蠕動減慢、結(jié)腸內(nèi)水液過度吸收和(或)分泌減少而表現(xiàn)為糞便干結(jié)而致大便排出困難密切相關(guān)。水通道蛋白(aquaporin,AQP)在人和動物胃腸道水液代謝中發(fā)揮著重要作用[4],其中水通道蛋白3(AQP3)、水通道蛋白9(AQP9)存在于結(jié)腸粘膜,并可調(diào)控結(jié)腸水液代謝[5-6]。本實驗擬通過觀察升降潤腸方對FC模型大鼠胃腸動力及結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9表達(dá)的影響,探討其治療FC的可能作用機(jī)制,為升降潤腸方治療兒童FC提供科學(xué)依據(jù),從而更好的應(yīng)用于兒科臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及環(huán)境

48只SPF級6～8周齡SD大鼠,雌、雄各24只,體質(zhì)量180～200 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物合格證號:110322210100863418。大鼠飼養(yǎng)于恒溫22℃,濕度40%～50%,12小時光照/黑夜交替的SPF級實驗室,均自由攝食,并定時清潔、更換飼料,所有實驗操作遵循實驗動物倫理委員會規(guī)定。該實驗通過實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號MDKN-2021-051)。

1.2 藥物

鹽酸小檗堿片(源葉生物,國藥準(zhǔn)字:S30593,5 g/片);升降潤腸方,組成:茯苓10 g、 橘紅10 g、鉤藤10 g、伏龍肝10 g、炙甘草6 g、桃仁10 g、當(dāng)歸10 g,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院藥房提供,并由院內(nèi)制劑室水煎煮制備成含生藥1.15 g/mL的藥液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?乳果糖口服溶液(湖南科倫制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字:H20093523,0.667 g/mL)。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗鼠AQP3多克隆抗體(Abcam,貨號:ab125219)、雞抗鼠AQP9多克隆抗體(Abcam,貨號:ab15129);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo,貨號:Cat No.23225);TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司];AQP3、AQP9、GAPDH引物均在北京Invitrogen公司合成。

低溫臺式離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,型號:TGL-16),熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,型號:ABI7500),曝光儀(上海易孛特,型號:eBlot)。

1.4 動物分組及模型制備

48只大鼠正常喂養(yǎng)和觀察1周后稱重,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、乳果糖組、升降潤腸方組,每組12只,雌、雄各半。參照吳迪等[7]的造模方法并略作改進(jìn):各組大鼠禁食不禁水12小時后,空白組每日1次予生理鹽水0.2 mL/(10 g·d)灌胃,其余組每日1次予鹽酸小檗堿5 mg/(10 g·d),加生理鹽水2 mL配制成的混懸液灌胃,連續(xù)灌胃21天進(jìn)行造模,期間不限食水。當(dāng)大鼠出現(xiàn)6小時內(nèi)排便粒數(shù)減少、大便粒形小且干硬時為造模成功。

1.5 干預(yù)方法

空白組、模型組均予生理鹽水1 mL/次,2次/天,灌胃;根據(jù)動物藥物劑量換算公式:大鼠劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×折算系數(shù)(6.25),按成人體質(zhì)量60 kg計算,乳果糖組,予乳果糖口服溶液1mL/(次·天)[乳果糖日服劑量30 mL換算成SD大鼠3.1 mL/(kg·d)],第2次灌胃予生理鹽水1 mL/次;升降潤腸方組予中藥液1 mL/次,2次/天灌胃[升降潤腸方日服劑量66 g生藥換算成SD大鼠6.9 g/(kg·d)];四組均連續(xù)灌胃14天。

1.6 標(biāo)本采集

末次給藥后每組隨機(jī)抓取大鼠雌、雄各3只,禁食不禁水12小時,將活性炭按0.1 mL/10 mg的比例進(jìn)行灌胃30分鐘后,脫頸處死大鼠,做胃排空率、碳墨推進(jìn)率、結(jié)腸糞粒數(shù)測定;余大鼠禁食不禁水12小時后,用3%戊巴比妥鈉麻醉后剖腹取近端結(jié)腸組織30 mm左右平分3段沖洗,1段放入4%甲醛中固定備用以待免疫組化,另2段置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆靡源龑崟r熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白印跡(Western blot,WB)。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 胃腸動力測定 將計算好的活性炭灌胃30分鐘后脫頸處死大鼠,取胃稱重,用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物后再次稱重,胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/胃全重]×100%;剪取腸管測量小腸總長度,從幽門至活性炭前沿的距離視為腸管內(nèi)推進(jìn)距離,碳墨推進(jìn)率=(腸管內(nèi)推進(jìn)距離/小腸全長)×100%;并記錄整個結(jié)腸內(nèi)糞便存留的粒數(shù)。

1.7.2 免疫組化染色 取備用的結(jié)腸組織,采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色,通過Motic3000顯微鏡在400倍下觀察切片,陽性結(jié)果為棕色或者棕黃色。采用Image-pro Plus圖像分析系統(tǒng),計算平均光密度值并觀察AQP3、AQP9在結(jié)腸黏膜中的分布及表達(dá)情況。

1.7.3 qRT-PCR檢測 取備用結(jié)腸組織,采用TRNzol總RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取,進(jìn)行RNA濃度、純度檢測,以A260/A280比值范圍1.8～2.1為較高純度RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物見表1,每個樣本檢測3個復(fù)孔。原始檢測數(shù)據(jù)采用2-△△ct相對定量公式計算。

表1 引物序列

1.7.4 WB檢測 取結(jié)腸組織,RIPA裂解液抽提蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,計算調(diào)整蛋白濃度,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育、漂洗后將其顯色、曝光、顯影;β-actin選作內(nèi)參,Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃腸動力比較

與空白組相比,模型組的胃排空率、碳墨推進(jìn)率降低、存留糞粒數(shù)增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示便秘模型復(fù)制成功。與模型組相比,乳果糖組的胃排空率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),升降潤腸方組的胃排空率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,兩組的碳墨推進(jìn)率均增加、存留糞粒數(shù)均減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組的胃排空率增加(P<0.05),但兩組的碳墨推進(jìn)率、存留糞粒數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 各組大鼠胃排空率比較鼠只=6)

表3 各組大鼠腸道炭墨推進(jìn)率及存留糞粒數(shù)比較

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP9的分布及表達(dá)情況比較

2.2.1 免疫組化檢測 AQP3陽性細(xì)胞主要位于結(jié)腸黏膜表層柱狀上皮,且均為吸收細(xì)胞胞漿著色,杯狀細(xì)胞未見到陽性著色(圖1)。AQP9陽性細(xì)胞主要位于結(jié)腸黏膜表層柱狀上皮,且均為杯狀細(xì)胞胞漿著色,吸收細(xì)胞未見到陽性著色(圖2)。與空白組相比,模型組AQP3的平均光密度值升高,AQP9的平均光密度值降低(P<0.05)。與模型組相比,乳果糖組AQP3的平均光密度值均降低(P<0.05),AQP9的平均光密度值升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,升降潤腸方組AQP3的平均光密度值降低(P<0.05),AQP9的平均光密度值升高(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組AQP3的平均光密度值降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),AQP9的平均光密度值升高 (P<0.05)。見表4。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

表4 各組大鼠近端結(jié)腸黏膜組織AQP3、AQP9平均光密度值比較

2.2.2 qRT-PCR、WB檢測 與空白組相比,模型組AQP3 mRNA及蛋白表達(dá)上升,AQP9 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。與模型組相比,乳果糖組AQP3 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達(dá)升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,升降潤腸方組AQP3 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達(dá)上升(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組AQP3 mRNA及蛋白表達(dá)降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達(dá)上升(P<0.05)。見表5、6及圖3。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

表5 各組大鼠近端結(jié)腸黏膜組織AQP3、AQP9 mRNA水平比較

表6 各組大鼠近端結(jié)腸黏膜組織AQP3、AQP9蛋白表達(dá)水平

4 討論

既往認(rèn)為小兒便秘以飲食積滯、燥熱內(nèi)結(jié)證最為常見[8-9],治療多以消食導(dǎo)滯、清熱潤腸通便為主。閆慧敏教授根據(jù)小兒“脾常不足、肝常有余、肺常不足”的生理特點及“絡(luò)病理論”[10],從脾虛腸燥論治,創(chuàng)立了升降潤腸方,該方運(yùn)脾生津、潤腸通便、調(diào)暢氣機(jī),思路新穎。在實際應(yīng)用中根據(jù)患兒脾虛、腸燥、氣滯程度不同,往往酌情加用白術(shù)、火麻仁、炒苦杏仁、生地黃、白芍、枳實、厚樸等,經(jīng)前期臨床研究證實療效顯著。

慢傳輸型便秘是兒童功能性便秘的常見類型,是由各種原因引起的結(jié)腸運(yùn)動功能遲緩、傳輸糞便能力下降而導(dǎo)致的便秘[11],其發(fā)病機(jī)制與腸神經(jīng)系統(tǒng)病變、神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常、Cajal間質(zhì)細(xì)胞異常、平滑肌功能障礙、精神心理問題、腸道菌群失調(diào)等相關(guān)[12]。本實驗結(jié)果顯示模型組大鼠的胃排空率及碳墨推進(jìn)率低于空白組,結(jié)腸糞粒存留粒數(shù)高于空白組(P<0.05),提示該模型為慢傳輸型便秘模型。與模型組相比,升降潤腸方可以促進(jìn)FC模型大鼠胃腸動力(P<0.05),且在促進(jìn)胃動力方面優(yōu)于乳果糖(P<0.05)。說明升降潤腸方可促進(jìn)慢傳輸型FC模型大鼠的胃腸動力,從而縮短糞便在結(jié)腸的存留時間,減少水分吸收,以緩解便秘。

功能性便秘的發(fā)生與腸道水液代謝障礙有關(guān)[13],對人體而言,結(jié)腸上皮細(xì)胞每天需要逆滲透壓濃度梯度吸收1.5～2 L的水來保證大便成型,然而,在某些生理和病理條件下,結(jié)腸上皮細(xì)胞也能分泌水分和電解質(zhì),AQPs在胃腸上皮細(xì)胞水液的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用,其功能的發(fā)揮與它所在的位置之間似乎有密切的關(guān)系[14]。AQP3是一種在食道、結(jié)腸近端和遠(yuǎn)端表達(dá)豐富的水通道蛋白,其精確定位在基底外側(cè)膜的單層柱狀上皮細(xì)胞[15]。在嗎啡誘導(dǎo)的便秘模型大鼠中,結(jié)腸黏膜AQP3的表達(dá)水平升高,促進(jìn)水分由腸腔側(cè)到血管側(cè)的吸收,并導(dǎo)致便秘[16];利用HgCl2和CuSO4抑制大鼠AQP3的功能,則可導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉[17];以上說明AQP3在調(diào)節(jié)腸道水液平衡方面起著關(guān)鍵作用。早期研究證實AQP9主要存在于人類和大鼠的肝臟,并可允許各種各樣的水和中性溶質(zhì)通過[18];近年袁維堂等[6]發(fā)現(xiàn)AQP9存在于人類結(jié)腸,且便秘患者降結(jié)腸黏膜AQP9蛋白表達(dá)低于非便秘者;趙兵等[19]證實便秘大鼠結(jié)腸中AQP9表達(dá)水平明顯降低,經(jīng)治療后AQP9表達(dá)水平顯著提高,推測AQP9減少可能影響腸道黏液分泌,導(dǎo)致糞便含水量不足,形成干結(jié)糞便,從而引起便秘。本研究免疫組化示AQP3、AQP9分別主要存在結(jié)腸黏膜上皮層的吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞;吸收細(xì)胞參與水分的吸收而致糞便含水量降低;杯狀細(xì)胞參與結(jié)腸黏液分泌、潤滑腸道促進(jìn)糞便排出,與既往研究一致[20]。本研究結(jié)果示模型組結(jié)腸黏膜AQP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于空白組,AQP9低于空白組(P<0.05),說明二者參與了大鼠FC的發(fā)生。而與模型組相比,升降潤腸方組結(jié)腸黏膜AQP3水平下降,AQP9上升(P<0.05),這從分子機(jī)制證實了升降潤腸方具有生津、潤腸通便的作用。研究同時表明,升降潤腸方組結(jié)腸黏膜AQP9水平高于乳果糖組(P<0.05),但AQP3水平較乳果糖組無明顯差異(P>0.05)。

本研究仍有一定的局限,僅檢測了升降潤腸方對胃腸動力及AQP3、AQP9的影響,仍需進(jìn)一步探究神經(jīng)遞質(zhì)、腸道菌群等對胃腸動力的影響及VIP-cAMP-PKA、NF-κB等信號通路對AQP3、AQP9具體調(diào)控機(jī)制,以更深層次明確升降潤腸方治療便秘的生物學(xué)機(jī)制。

綜上所述,升降潤腸方可促進(jìn)FC模型大鼠胃排空率、碳墨推進(jìn)率,減少糞粒存留,同時能調(diào)控結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9的表達(dá),其在促進(jìn)胃排空率及上調(diào)AQP9的表達(dá)方面優(yōu)于乳果糖。故升降潤腸方治療兒童FC的作用機(jī)制與其能促進(jìn)胃腸動力,下調(diào)近端結(jié)腸黏膜AQP3及上調(diào)近端結(jié)腸黏膜AQP9的表達(dá)相關(guān)。