黃 薇，凌睿云，高樂欣，唐 文，錢令波，陳峰陽

杭州醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，浙江 杭州 310053

CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞,即Treg細胞,是CD4+T細胞的免疫抑制亞群,其特征是轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達上調(diào)。Treg細胞是維持免疫耐受和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的正常免疫系統(tǒng)不可或缺的組成部分,然而,在多數(shù)腫瘤的微環(huán)境中,聚集的Treg細胞抑制抗腫瘤免疫反應,進而促進腫瘤進展[1]。因此,Treg細胞與腫瘤的免疫逃逸、耐藥以及不良預后都密切相關(guān)[2]。

近年來,腫瘤的治療手段日新月異,但化學治療(化療)仍是臨床治療的主要手段,而腫瘤耐藥是化療藥物難以為繼、無法達到預期治療效果的主要障礙。腫瘤化療藥物引起耐藥的原因多樣,期中一個重要原因是腫瘤免疫微環(huán)境的改變,包括Treg細胞比例或功能的改變[3]。研究發(fā)現(xiàn),有些化療藥如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和吉西他濱(gemci-tabine)能降低腫瘤微環(huán)境Treg細胞的比例[4],而博來霉素(bleomycin)則會提高Treg細胞的比例[5],但大部分化療藥物對Treg細胞的影響并不清楚。

為了更好的了解化療藥物對Treg細胞的影響,進而進一步明確化療藥物對免疫微環(huán)境的改變及耐藥機制,本文選取20種臨床常用的化療藥,體外觀察了其對Treg細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雌性C57BL/6小鼠,6周齡[上海斯萊克實驗動物有限責任公司,合格證號:SCXK(滬)2017-0005]。實驗動物購得后飼養(yǎng)1周再進行實驗。

1.1.2 主要試劑:重組小鼠IL-2、FITC-抗小鼠-TCRβ和PerCP-Cy5.5抗小鼠-CD4(BD Pharmingen 公司);APC抗小鼠-Foxp3及其同型(isotype)對照、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set和CellTraceTMViolet (Thermo Fisher Scientifc公司);20種化療藥標準品(上海阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾Treg細胞的分離:無菌取小鼠脾臟,制成單細胞懸液,細胞篩過濾及PBS洗滌后以含1%青霉素和鏈霉素及10% FBS的1640培養(yǎng)液混懸。

1.2.2 Treg細胞增殖的測定:取小鼠脾細胞,先用CellTraceTMViolet 標記,后調(diào)整濃度為1×1010個/L。于96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔加入細胞懸液100 μL,再加入重組小鼠IL-2及化療藥物各50 μL。IL-2的濃度為250 ng/L,化療藥物的濃度根據(jù)先前對脾細胞的毒性測定結(jié)果而定,采用無細胞毒性的最大濃度。3組細胞分別是control組(1640培養(yǎng)液); IL-2組(250 ng/L IL-2);化療藥物組(IL-2+化療藥)。培養(yǎng)3 d后,收集細胞,采用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set破膜和固定,以熒光抗體FITC-TCRβ、PerCP-Cy5.5-CD4和APC-Foxp3標記后,流式細胞儀測定Foxp3+CD4+T細胞比例及CellTrace標記的增殖細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 吉西他濱明顯抑制IL-2誘導的Treg細胞的增殖

與對照組相比,IL-2刺激后,CD4+T細胞中Foxp3+Treg細胞的比例明顯增加(P<0.05);進入細胞分裂周期的Treg細胞數(shù)也從正常組的約16%提高到約42%(P<0.05)。加入吉西他濱后,細胞分裂周期的Treg細胞數(shù)顯著降低(圖1)。

圖1 FACS測定Treg細胞比例和增殖Fig 1 Proportion and proliferation of Treg cells were assayed by FACS

2.2 20種化療藥對IL-2誘導的Treg細胞增殖的影響

按照上述方法,共檢測20個化療藥在無細胞毒性濃度下的作用。有12個能顯著抑制IL-2誘導的Foxp3+Treg細胞增殖 (P<0.05),表現(xiàn)為Foxp3+Treg細胞比例的減少和分裂細胞數(shù)的降低(表1)。

表1 20種化療藥對IL-2誘導的Treg細胞增殖的影響Table 1 Effects of 20 chemotherapeutic agents on the proliferation of Treg cells induced by n=3)

3 討論

在腫瘤組織中,Treg細胞可以通過搶奪效應T細胞所需的IL-2,高表達CTLA-4分子干擾抗原遞呈細胞,分泌免疫抑制性細胞因子而抑制或殺傷其他抗腫瘤免疫細胞。因此,降低腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的數(shù)目或抑制其功能近年來被認為是抗腫瘤免疫治療的新途徑[6]。吉西他濱(gemcitabine)能減少胰腺癌患者的外周血中Treg細胞的比例[7]。多西他賽(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)治療非小細胞肺癌后,患者外周血中Treg細胞的比例也顯著降低[8-9]。表柔比星(epirubicin)能抑制小鼠Treg細胞的免疫抑制功能從而促進效應T細胞的功能[10]。與這些報道相似,本結(jié)果同樣顯示吉西他濱、多西他賽、紫杉醇和表柔比星能直接抑制IL-2誘導的Treg細胞增殖。奧沙利鉑(oxaliplatin)在結(jié)腸癌中能促進Treg細胞的增殖引起耐藥[11],而本研究同樣發(fā)現(xiàn)其對Treg細胞增殖的抑制作用。由于實驗條件及體內(nèi)外實驗的差異, 奧沙利鉑對Treg細胞的確切影響還需要更多的證據(jù)。大部分化療藥對Treg細胞的影響迄今未見報道,本研究發(fā)現(xiàn),阿糖胞苷(cytarabine)、長春地辛(vindesine)、伊立替康(irinotecan)等另外7個化療藥對Treg細胞的增殖具有明顯的抑制作用,卡培他濱(capecitabine)、順鉑(cisplatin)、培美曲賽(pemetrexed)等8個藥物則沒有明顯的影響。雖然化療藥調(diào)節(jié)Treg細胞的作用已有一些報道,但其作用機制并不清楚。本研究中,影響微管蛋白的3個藥物, 干擾轉(zhuǎn)錄和RNA合成的3個藥物及2個拓撲異構(gòu)酶抑制劑均能抑制Treg細胞增殖;而7個抑制核酸合成藥物及4個鉑類藥物的結(jié)果并不一致?；熕幊耸熘目鼓[瘤靶點外,通常也會脫靶產(chǎn)生其他生物效應。Treg細胞表面表達有豐富的IL-2受體CD25,因此在IL-2作用下活化增殖,其機制主要與STAT5、Ras-Raf-MAPK和PI3K信號通路有關(guān)[12]。上述12種有效化療藥可能通過這3種途徑發(fā)揮抑制Treg增殖的作用。當然,本實驗只是體外細胞水平的觀察,其結(jié)果有待體內(nèi)實驗尤其是臨床腫瘤患者的觀察和驗證。

總之,通過對20種臨床常用的化療藥作用于Treg細胞的觀察,本研究發(fā)現(xiàn)有12種藥物能顯著抑制Treg細胞的增殖。表明除了常規(guī)作用機制外,這12種化療藥也可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的增殖而進一步發(fā)揮抗腫瘤效果。該結(jié)果對進一步闡明這些化療藥物的藥理作用機制及耐藥機制提供了一定的實驗依據(jù)。