張 祥 郝亞榮

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由于糖尿病引起的廣泛的心肌血管疾病和心肌代謝紊亂引起的心肌壞死性疾病[1, 2]。糖尿病心肌病早期只表現(xiàn)為心肌細(xì)胞代謝紊亂和簡(jiǎn)單的心臟組織結(jié)構(gòu)變化,后期由于左心室心肌細(xì)胞體積、心室壁厚和重量增加,舒張功能降低,逐漸發(fā)展為心肌細(xì)胞凋亡、壞死和肥大、纖維化,導(dǎo)致明顯的舒張和收縮功能障礙,最終可能發(fā)展成缺血性心臟病和心力衰竭,因此,現(xiàn)階段對(duì)其尚未研究出療效較好的治療手段[3]。

松果菊苷(echinacoside,ECH)是從管花肉蓯蓉莖中分離出來(lái)的天然化合物,其主要化學(xué)成分是苯乙醇苷[4]。通過(guò)體內(nèi)外研究其已被證明其具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、提高記憶力與神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、保護(hù)肝臟及免疫調(diào)節(jié)等作用[5～7]。既往研究顯示,ECH可以調(diào)節(jié)TGF-β及其下游基因的表達(dá)水平,改善db/db小鼠糖尿病腎病的腎纖維化進(jìn)程[8～11]。本研究使用db/db小鼠作為DCM動(dòng)物疾病模型,探究松果菊苷如何改善糖尿病心肌病心肌細(xì)胞損傷及內(nèi)在機(jī)制,以期為糖尿病心肌病的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)采用從南京大學(xué)南京生物醫(yī)學(xué)研究所(中國(guó)南京)購(gòu)買(mǎi)的成年雄性C57BLKS/J db/db小鼠和db/m小鼠(SPF級(jí)),編號(hào):SCXK(蘇)2015-0001。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間,室溫20℃,相對(duì)濕度50%～60%, 24h光照晝夜循環(huán),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,不給予任何降糖藥物。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):20190517)。

2.儀器與試劑:ECH(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,批號(hào):150623)、RT-PCR轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司,批號(hào):11141ES10);SH-520型成像系統(tǒng)(Q-IMAGING公司);RT-q PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司);DYY7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);電子天平(METTER TOLEDO公司);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):10023418);DAPI染液(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司,批號(hào):AS1075);全自動(dòng)顯微鏡BX63(日本Olympus公司);TRIZOL試劑(美國(guó)Invitrogen公司,批號(hào):15596-026);抗熒光淬滅封片劑(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司,批號(hào):AS1089);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(7500序列檢測(cè)系統(tǒng))(美國(guó)ABI公司);TUNEL試劑盒(美國(guó)Roche公司,批號(hào):11684817910);Biomek 4000 Automated Workstation基因擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)。

3.分組及給藥:將29只SPF級(jí)6周齡雄性db/db小鼠和db/m小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按照隨機(jī)數(shù)字表法將db/db小鼠分為糖尿病心肌病組(db/db組,n=10)與松果菊苷干預(yù)組(db/db+ECH組,n=10),取9只db/m小鼠作為正常對(duì)照組(db/m組,n=9)。其中db/db組和db/m組每日按照0.05ml/10g標(biāo)準(zhǔn)行0.9%氯化鈉溶液灌胃10周。db/db+ECH組小鼠按松果菊苷300mg/(kg·d)灌胃10周。每周監(jiān)測(cè)3組小鼠體質(zhì)量和血糖,觀察小鼠攝食、飲水及活動(dòng)情況。于第10周末用2%戊巴比妥鈉0.1ml/10g腹腔注射麻醉小鼠并處死。毛細(xì)血管針眶后采血,分離血清后全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血脂水平。心臟灌注后進(jìn)行組織分離,稱取心臟濕重。取少量左心室心肌組織采用4%多聚甲醛固定后,用于心肌組織切片染色觀察病理形態(tài)。其余心臟組織置于液氮中1h后,-80℃冰箱保存,用于RT-PCR和Western blot法檢測(cè)p53/p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)因子的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

4.心臟組織切片TUNEL染色心肌細(xì)胞凋亡水平:通過(guò)TUNEL試劑盒能夠測(cè)試心肌細(xì)胞凋亡水平。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡晚期階段時(shí),細(xì)胞核DNA出現(xiàn)斷裂,受末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化影響,3′-OH暴露部分在熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)作用下,以此達(dá)到借助熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的目的。將心肌組織切片放入二甲苯洗兩次,每次5min;用無(wú)水乙醇洗兩次,每次3min;用95%和75%乙醇各洗1次,每次3min;PBS沖洗5min后加入蛋白酶K溶液(20μg/ml),室溫下水解15min;蒸餾水洗4次,每次2min;色缸中加入含2%過(guò)氧化氫的PBS,于室溫下反應(yīng)5min;然后用PBS洗兩次,每次5min;濾紙吸去多余液體后,于切片上滴加TdT酶緩沖液,置于室溫下5min;濾紙吸去多余液體后,于切片上滴加54μl TdT酶反應(yīng)液,置于濕盒中于37℃反應(yīng)1h;切片置于染色缸中,加入預(yù)熱的37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液,保溫30min,每10min輕輕晃動(dòng)切片1次;組織切片用PBS沖洗3次,每次5min,直接在切片上滴入抗熒光淬滅封片劑后封片,觀察并拍照統(tǒng)計(jì)凋亡率。

5.HE染色觀察心肌組織病理改變:取適量心臟組織塊,用PBS沖洗后,放入4%多聚甲醛緩沖液固定12～24h。將心臟組織依次放入石蠟Ⅰ 1h,石蠟Ⅱ 2h包埋;包埋后適當(dāng)修剪,用切片機(jī)切成4μm的石蠟帶,將組織石蠟塊放入石蠟切片置于烘箱中60℃烤1～2h;石蠟切片常規(guī)二甲苯,乙醇脫蠟至水;之后用蘇木精染10min,流水沖洗,去余色。以0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘,流水沖洗,切片變藍(lán)約15min;乙醇梯度(70%、80%、95%到無(wú)水乙醇)脫水,二甲苯透明;最后中性樹(shù)脂封片,晾干后置于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

6.Western blot法測(cè)定小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá)水平:每組小鼠取50mg的心臟組織,組織剪取細(xì)小心肌組織碎片,并添入蛋白裂解液混勻,在此基礎(chǔ)上注加與之相符的1mmol/L的PMSF抑制組織蛋白降解20min;1200r/min進(jìn)行離心10min,吸取上清液,并采取BCA法獲取蛋白濃度。在1∶1的配平標(biāo)準(zhǔn)下,混合蛋白樣品和SDS-PAGE上樣緩沖液(2×),沸水浴變性10min,取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上,之后取5%脫脂牛奶搖床封閉1h,在注入(1∶800)的一抗稀釋液后,4℃搖床過(guò)夜。洗膜后,注入(1∶5000)的兔抗兔二抗稀釋液,在室溫狀態(tài)下孵化1h,完成洗膜后掃膜顯色,對(duì)各組條帶蛋白進(jìn)行灰度值分析。

7.RT-qPCR檢測(cè)小鼠心臟組織中p53、p38MAPK mRNA和caspase-3mRNA、Bcl-2/Bax mRNA的表達(dá)水平:從各組小鼠內(nèi)取出100mg的心臟組織,采取Trizol法提出總RNA,采用基因擴(kuò)增儀經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA后,在所有樣本中添加3個(gè)復(fù)孔。在95℃的基礎(chǔ)上,維持30s的預(yù)變性,并采取以下40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增:PCR反應(yīng)中,在95℃維持5s,在60℃維持40s;溶解過(guò)程中,在95℃維持15s,在60℃維持60s,在95℃維持15s。選擇管家基因GAPDH進(jìn)行參照比對(duì),利用ABI7500軟件2-ΔΔct法完成處理過(guò)程,引物序列參照表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

結(jié) 果

1.小鼠的一般情況及ECH對(duì)小鼠體質(zhì)量、心臟濕重、血糖的影響:db/m組小鼠攝食與飲水正常,較活躍,皮毛光滑。db/db組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)多飲、多尿、多食,少動(dòng)等現(xiàn)象。db/db+ECH組小鼠的上訴癥狀有所緩解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,db/db組小鼠和db/db+ECH組小鼠空腹血糖持續(xù)升高,而db/m組血糖水平保持穩(wěn)定。相較于db/db組小鼠,db/db+ECH組小鼠空腹血糖水平顯著下降(P<0.01)。這表明, ECH對(duì)db/db小鼠高血糖狀態(tài)具有改善作用。db/db組心臟濕重較db/m組明顯減輕(1.627±0.063g vs 1.982±0.076g,P<0.01);而與db/db組小鼠比較,db/db+ECH組小鼠心臟濕重顯著增加(1.749±0.070g vs 1.627±0.063g,P<0.05)。相較于db/m組小鼠,db/db組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01),且表現(xiàn)出明顯的肥胖癥狀;而經(jīng)過(guò)10周的ECH干預(yù)治療后,db/db小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05),證明ECH對(duì)db/db小鼠心臟功能和肥胖癥狀具有改善作用(表2)。

表2 松果菊苷對(duì)各組小鼠血糖水平、心臟濕重、體質(zhì)量的影響

2.ECH對(duì)小鼠血脂水平及心臟功能的影響:db/db組和db/m組進(jìn)行比較,小鼠血清甘油三酯(triglyceride,TG),天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)水平都顯著增加(P<0.01);db/db+ECH組與db/m組進(jìn)行比較,上述指標(biāo)都顯著降低(P<0.01,表3)。

表3 菊苷對(duì)db/db小鼠血清ALT、AST、TG水平的影響

3.ECH對(duì)小鼠心臟形態(tài)學(xué)的影響:HE染色顯示,db/m組心臟正常,心肌細(xì)胞排列清晰致密,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞外基質(zhì)及纖維組織少。而db/db組心肌細(xì)胞明顯肥大壞死,心肌細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞外基質(zhì)沉積較少。與db/db組比較,db/db+ECH組心肌細(xì)胞形態(tài)顯著改善,細(xì)胞間隙縮小,排列規(guī)則,細(xì)胞外基質(zhì)沉積改善(圖1)。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞HE、TUNEL染色圖(×200)

4.ECH對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響:采用TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,與db/m組比較,db/db組心肌細(xì)胞總凋亡率明顯升高(1.861%±0.494% vs 31.661%±2.889%,P<0.01)。與db/db組比較,db/db+ECH組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯降低(31.661%±2.889% vs 8.351%±1.133%,P<0.01),說(shuō)明ECH可以顯著降低db/db心肌細(xì)胞的凋亡率(圖1)。

5.ECH對(duì)小鼠心臟組織p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,較db/m組,db/db組小鼠心肌細(xì)胞p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與db/db組比較,db/db+ECH組蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,表4)。

表4 各組細(xì)胞caspase-8、p53、caspase-3、p38MAPK和內(nèi)參β-actin的灰度比

6.ECH對(duì)小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)水平的影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,較db/m組,db/db組小鼠心肌細(xì)胞p53、p38MAPK、caspase-3mRNA水平明顯升高,Bcl-2/Bax水平降低(P<0.01);經(jīng)ECH干預(yù)后,db/db+ECH組相關(guān)mRNA水平較db/db組顯著改善(P<0.01,表5)。

表5 各組caspase-3、p38MAPK、p53、Bcl-2/Bax mRNA相對(duì)量

討 論

糖尿病作為一種常見(jiàn)的慢性代謝紊亂癥,被認(rèn)為是一種心血管疾病而非碳水化合物的代謝紊亂[12, 13]。不斷有實(shí)驗(yàn)研究和臨床證據(jù)表明,糖尿病心肌病心肌功能不全與心肌細(xì)胞凋亡引起的心肌損傷密切相關(guān)[14]。本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物db/db小鼠是由于瘦素受體基因異常剪接產(chǎn)生突變而具有明顯的高血糖、高血脂、高胰島素血癥等2型糖尿病特征,并且可以維持較為穩(wěn)定的高血糖狀態(tài),是糖尿病心肌病的常用造模對(duì)象[15]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)db/db小鼠進(jìn)行ECH灌胃治療,觀察ECH對(duì)糖尿病小鼠心臟損傷的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)ECH治療后,db/db組小鼠體質(zhì)量、血清葡萄糖水平亦有所降低(表2),證明ECH對(duì)db/db糖尿病小鼠糖尿病癥狀有改善作用。能量代謝紊亂作為糖尿病心肌病的重要發(fā)病機(jī)制之一,參與了糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展[16, 17]。ALT、AST和TG雖常用來(lái)檢測(cè)肝臟代謝指標(biāo),但研究發(fā)現(xiàn),其在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中,上述物質(zhì)釋放入血,血清水平會(huì)有所增高,并且血清TG水平增高的病理改變能夠加重糖尿病心肌病心肌脂質(zhì)沉積,進(jìn)一步加速DCM的惡化[18, 19]。通過(guò)檢測(cè)血清中ALT、AST和TG水平,筆者發(fā)現(xiàn)與db/m組比較,db/db組上述指標(biāo)均明顯升高,而ECH能夠抑制血清ALT、AST和TG水平的升高趨勢(shì)(表3)。

研究證實(shí),高糖培養(yǎng)24h的H9c2心肌細(xì)胞,p-p38MAPK表達(dá)增加,凋亡細(xì)胞增加,活性氧增加,以及線粒體膜電位下降[20]。高糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、氧化應(yīng)激等因素可通過(guò)p38MAPK通路引起細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能與p53、Bax、Bcl-2、氧化應(yīng)激等有關(guān)[21]。本研究中db/db小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3蛋白表達(dá)水平較db/m組明顯升高(表5)。在db/db+ECH組小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3水平較db/db組顯著升高,Bcl-2/Bax mRNA水平顯著降低(表6),說(shuō)明在糖尿病小鼠中p53/p38MAPK通路的激活,促進(jìn)p38MAPK磷酸化從而激活下游相關(guān)凋亡蛋白caspase家族,上調(diào)caspase-3和caspase-8表達(dá)水平,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá),最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡;而經(jīng)ECH灌胃處理后,db/db小鼠能夠明顯抑制p53/p38MAPK通路的激活,影響db/db小鼠的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程,并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)心臟功能,這一點(diǎn)與HE染色及TUNEL染色觀察到的心臟組織形態(tài)學(xué)改變一致。

綜上所述,本研究表明在db/db小鼠心臟組織中心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的重要病理機(jī)制,ECH能夠保護(hù)db/db小鼠的心臟功能,其機(jī)制可能與抑制p53/p38MAPK/caspase信號(hào)通路,調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)從而改善心肌凋亡有關(guān)。