辛林林 王浩南 張喆 白艷紅 劉紅燕 周穎 李慶軍 劉謙 張永清

[摘要]目的：研究丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblasts，HSF）抑制瘢痕形成的影響及分子機(jī)制。方法：配制丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物（丹參酮ⅡA與隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶1的比例配置）溶液，采用TGF-β1誘導(dǎo)HSF細(xì)胞增殖構(gòu)建增生性瘢痕體外細(xì)胞模型；采用MTT法測(cè)定丹參酮ⅡA與隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖的影響；采用Western Blot法檢測(cè)HSF細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)通路下游信號(hào)分子p-Smad2、Smad3蛋白以及Survivin蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果：丹參酮ⅡA與隱丹參酮能劑量依賴(lài)地抑制HSF細(xì)胞的增殖，降低p-Smad2、Smad3蛋白和Survivin蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物可能通過(guò)下調(diào)p-Smad2、3和Survivin蛋白的水平，抑制HSF細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抑制瘢痕的作用。

[關(guān)鍵詞]丹參酮ⅡA；隱丹參酮；人皮膚成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；瘢痕

[中圖分類(lèi)號(hào)]R285? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）09-0054-04

Inhibition of Tanshinone ⅡA and Cryptotanshinone? Mixture on Human Skin Fibroblasts Based on TGF-β1

XIN Linlin，WANG Haonan，ZHANG Zhe，BAI Yanhong，LIU Hongyan，ZHOU Ying，LI Qingjun，LIU Qian，ZHANG Yongqing

（College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Abstract： Objective? To explore the effect and mechanism of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture on the proliferation of fibroblasts stimulated by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， and to provide a theoretical basis for further development and utilization of Danshen. Methods? Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture （Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone were mixed at a ratio of 1∶1） was prepared to treat human skin fibroblasts （HSF） cells which was stimulated by TGF-β1. The effect of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone on the proliferation of HSF cells was determined using MTT method. The expression levels of protein p-Smad2， 3 and Survivin， downstream signals of TGF-β1/Smad pathway， were determined by western blot （WB）. Results? The results showed that tanshinone ⅡA and cryptotanshinone could inhibit the proliferation of HSF cells and suppress the expression levels of p-Smad2， 3 and Survivin in a dose-dependent manner. Conclusion? Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture could inhibit the proliferation of HSF cells by significantly reducing the phosphorylation of Smad2 and 3， and down-regulating the expression level of Survivin.

Key words： tanshinone ⅡA; cryptotanshinone; human skin fibroblast; transforming growth factor-β1; scar

丹參為唇形科植物丹參的干燥根與根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血化瘀、清心除煩、通經(jīng)止痛、涼血消癰等功效。藥理研究證明，丹參對(duì)心、肝、肺、腎等臟器具有顯著的抗纖維化作用[2-4]，一般認(rèn)為是通過(guò)抑制HSF增殖與膠原纖維累積而實(shí)現(xiàn)的。本課題組前期對(duì)民間驗(yàn)方丹參膏進(jìn)行工藝優(yōu)化制成滅瘢膏，并對(duì)滅瘢膏進(jìn)行成分和藥效研究，結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA與隱丹參酮是滅瘢膏發(fā)揮抗皮膚組織纖維化的主要有效成分，含量分別為2.11 mg/g與2.20 mg/g且比例接近1∶1。為進(jìn)一步提高滅瘢膏的制劑工藝水平和臨床療效，本研究繼續(xù)通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)HSF細(xì)胞，從細(xì)胞和分子層面研究丹參酮ⅡA與隱丹參酮抑制瘢痕形成的機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源：人皮膚成纖維細(xì)胞（HFF-1，167921）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)擴(kuò)增，取第3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物和試劑：羊脂（20200616，泰安明睿有限公司），丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品（Y16M10C88487，上海源葉生物科技有限公司），隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品（C28M6Y1，上海源葉生物科技有限公司）；HFF-1特殊培養(yǎng)基（167921，中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（10270-106，Gibco）；p-Smad2抗體（#18338，Cell Signaling Technolog）、p-Smad 3抗體（#9520，Cell Signaling Technolog）；Survivin蛋白抗體（ab134170，Abcam），GAPDH抗體（ab179695，Abcam）；BCA總蛋白測(cè)定試劑盒（20201218，南京建成工程生物工程研究所）。

1.3 儀器：XD-101 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo）；IX 71生物倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）；muLISKANMK3酶標(biāo)儀（Thermo）；EPS300垂直電泳槽，Tanon 4 600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（Tanon）。

1.4 方法

1.4.1 HSF細(xì)胞培養(yǎng)條件與藥品配置

1.4.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件：HSF細(xì)胞用HFF-1特殊培養(yǎng)基于37℃、5% CO2、95% 相對(duì)飽和濕度環(huán)境下靜置培養(yǎng)至第3～8代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.1.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液配置：精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA與隱丹參酮，按照1μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液=1μmol丹參酮ⅡA+1 μmol隱丹參酮配制；為保證二甲基亞砜（DMSO）最終濃度為0.5%，以配置最高濃度64 mol/L的丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液為例，先配置10 ml濃度為12.8 mmol/L的丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液，原溶液經(jīng)2倍稀釋混勻成各濃度待用，給藥處理時(shí)取10μl原溶液與90μl培養(yǎng)基混合成混合液，取混合液10μl加入至細(xì)胞培養(yǎng)孔中（190μl）即可。

1.4.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1干預(yù)下HSF細(xì)胞增殖數(shù)的測(cè)定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育過(guò)夜后，將細(xì)胞分為blank組（0μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液），TGF-β1組（0μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液），丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組（1、2、4、8、16、32μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液）。TGF-β1組、丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組用5 ng/ml的TGF-β1干預(yù)處理2 h后全部分別按上述濃度給藥處理；孵育0 h和48 h時(shí)取出培養(yǎng)板，將稀釋在HFF-1特殊培養(yǎng)基中的MTT溶液加入孔中培養(yǎng)4 h后，移至酶標(biāo)板中檢測(cè)各組595 nm處吸光度（A）值。

1.4.3 丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖數(shù)的測(cè)定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育過(guò)夜后，將細(xì)胞分為blank組（0μmol/L），丹參酮ⅡA組（2、4、8、16、32、64μmol/L丹參酮ⅡA），隱丹參酮組（2、4、8、16、32、64μmol/L隱丹參酮），丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組（1、2、4、8、16、32μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物）全部分組按上述濃度給藥處理；孵育0 h和48 h時(shí)取出培養(yǎng)板，將稀釋在HFF-1特殊培養(yǎng)基中的MTT溶液加入孔中培養(yǎng)4 h后，移至酶標(biāo)板中檢測(cè)各組595 nm處吸光度（A）值。

1.4.4 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1干預(yù)下HSF細(xì)胞中p-Smad2/3，Survivin蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：取細(xì)胞樣本于離心管中加150μl裂解液超聲1 min后于冰上裂解30 min，裂解完畢后于4 ℃下12 000 r/min離心15 min后吸取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度；內(nèi)參蛋白為GAPDH，在10%SDS-PAGE凝膠電泳中進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫孵育1 h后4℃與下列抗體孵育過(guò)夜：p-Smad2（1∶1 000），p-Smad3（1∶1 000），Survivin（1∶300），GAPDH（1∶5 000），洗膜3次后加過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育40 min后洗膜3次，加免疫增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）劑反應(yīng)2 min后觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用Image J軟件對(duì)WB條帶進(jìn)行灰度分析，SPSS 23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2? 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖的影響：在48 h內(nèi)，丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖均起抑制作用，并呈劑量依賴(lài)性，濃度越高抑制作用越強(qiáng)，丹參酮ⅡA與隱丹參酮的IC50分別為：39.715 μmol/L、57.024μmol/L。見(jiàn)圖1。在干預(yù)48 h后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)HSF細(xì)胞起到抑制作用，IC50為29.705μmol/L，在不添加TGF-β1誘導(dǎo)的條件下，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)HSF的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下HSF細(xì)胞增殖的影響：與blank組比較，TGF-β1干預(yù)可顯著促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖（P＜0.01）。丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下的HSF細(xì)胞抑制率隨其濃度增加而升高，48 h時(shí)丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下HSF細(xì)胞IC50為41.949μmol/L。見(jiàn)圖3。

2.3 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)下HSF細(xì)胞中Smad2/3蛋白磷酸化和Survivin蛋白表達(dá)的影響：與blank組比較，TGF-β1干預(yù)可顯著促進(jìn)HSF細(xì)胞的Smad2、3蛋白磷酸化水平與Survivin蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），而丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物干預(yù)可明顯抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3蛋白磷酸化水平及Survivin蛋白表達(dá)水平，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴(lài)。結(jié)果可表明丹參酮ⅡA與隱丹參酮可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3磷酸化，下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)HSF細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制瘢痕形成。見(jiàn)圖4。

3? 討論

增生性瘢痕是一種纖維代謝性疾病，隨著細(xì)胞、分子生物學(xué)的不斷研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增生和凋亡失衡或許是增生性瘢痕形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)[5-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為其細(xì)胞凋亡不足、促凋亡基因或凋亡抑制基因表達(dá)紊亂都會(huì)導(dǎo)致瘢痕的產(chǎn)生[7]。HSF細(xì)胞參與皮膚創(chuàng)面愈合與瘢痕形成的全過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)，HSF細(xì)胞凋亡不足可能是導(dǎo)致增生性瘢痕產(chǎn)生的重要原因[8-9]。

中藥或中藥提取物能有效抑制瘢痕組織的形成并減少肌膚紅腫或過(guò)敏等副作用[10]。丹參作為常用大宗藥材之一，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、改善微循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，是治療增生性瘢痕的潛在藥物[11-12]。研究表明，丹參酮ⅡA可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)[13]。Zhan CY等[14]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠心臟HSF中Smad2/3磷酸化，阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)，降低心肌纖維化。楊莉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可以抑制兔耳增生性瘢痕產(chǎn)生，其機(jī)制可能與TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)，但尚未涉及隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞的干預(yù)功能及其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)HSF細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)隱丹參酮與丹參酮ⅡA與對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，兩種丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖活性均起到一定的抑制作用，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算，在48 h內(nèi)，隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對(duì)HSF細(xì)胞的IC50分別為57.024、39.715 和29.705μmol/L，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物與單純使用隱丹參酮、丹參酮ⅡA的IC50分別降低了47.91%與25.20%，提示相同作用時(shí)間下，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物能顯著抑制HSF細(xì)胞的增殖，減少瘢痕產(chǎn)生。

TGF-β1是與增生性瘢痕形成關(guān)系最密切的因子，能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化，調(diào)節(jié)膠原蛋白積累，維持纖維化平衡[16]。大量研究表明，TGF-β1通過(guò)激活Smad介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與膠原纖維代謝的調(diào)控，對(duì)傷口愈合和瘢痕形成的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用[17]。Survivin蛋白是目前已知最強(qiáng)凋亡蛋白抑制因子，與Caspase家族相互作用后，可以抑制HSF細(xì)胞凋亡，造成HSF細(xì)胞大量繁殖和膠原過(guò)度沉積[18]。已有研究證明，敲低Survivin蛋白的前列腺癌細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4表達(dá)水平明顯降低，Survivin蛋白過(guò)表達(dá)則可以增加TGF-β1、Smad4表達(dá)，促進(jìn)Smad2/3磷酸化[19]。同樣在銀屑病皮損組織中發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以激活Survivin蛋白的表達(dá)，通過(guò)TGF-β1/Survivin途徑干擾細(xì)胞增殖和凋亡[20]。本研究探討了丹參酮ⅡA與隱丹參酮對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路中p-Smad2/3、Survivin蛋白表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，HSF細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下，細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)，其Survivin蛋白以及p-Smad2/3水平顯著上升，在丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物進(jìn)行處理后，細(xì)胞增殖活性降低，Survivin、p-Smad2/3水平降低。

綜上所述，丹參酮ⅡA與隱丹參酮對(duì)HSF細(xì)胞增殖起到抑制作用，可以減少增生性瘢痕的產(chǎn)生，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)丹參用于外傷治療提供借鑒參考。

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[收稿日期]2022-07-13

本文引用格式：辛林林，王浩南，張喆，等.丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物基于TGF-β1抑制人皮膚成纖維細(xì)胞的研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（9）：54-57.