石巍然 米麗·提列克 吳素君 管娟

隨著社會老齡化問題的加劇，每年因骨質(zhì)疏松、骨髓炎等疾病導(dǎo)致骨缺陷或損傷的患者快速增加［1］。雖然生物體骨組織有一定的自愈合能力［2］，但是在受到嚴重和大范圍損傷時，自愈合能力明顯不足［3-4］。骨組織工程（tissue engineering，TE）被認為是目前臨床治療方案骨移植的替代策略。其目標是通過結(jié)合細胞、生物材料支架和信號因子創(chuàng)建3D 微環(huán)境來恢復(fù)骨組織的功能。理想的生物材料支架有望推動骨組織工程實現(xiàn)更安全、高效的骨組織修復(fù)［5-7］。天然蠶絲及其絲蛋白（silk fibroin，SF）具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性和可調(diào)控的力學(xué)性能，絲蛋白材料結(jié)合生物3D 打印技術(shù)，可以獲得骨組織工程支架。為了平衡微觀形貌、力學(xué)性能等多方面性能需求，研究人員從材料組成、制備工藝、結(jié)構(gòu)設(shè)計等方面開展了大量研究。Inzana等［8］研究的低溫3D 打印磷酸鈣支架為制備合成骨移植替代物帶來了巨大的希望，其支架性能優(yōu)于傳統(tǒng)支架；Farokhi 等［9］探 討 了SF 和 羥 基 磷 灰 石（hydroxyapatite，HAp）兩種材料在骨組織工程中應(yīng)用的優(yōu)勢，指出復(fù)合了納米相的HAp-SF 支架在體外和體內(nèi)試驗中獲得了促進骨細胞生長和骨組織修復(fù)的有益結(jié)果。盡管高濃度純絲蛋白水溶液作為生物3D 打印墨水在支架的力學(xué)性能和降解性能方面有優(yōu)勢，但其粘度相對低且剪切變稀行為明顯，打印過程中成型性能不佳。因此，基于絲蛋白生物墨水3D 制備骨組織工程支架仍極具挑戰(zhàn)，而基于羥基磷灰石與絲蛋白復(fù)合體系的擠出式3D 打印工藝也很少報道。本研究采用擠出式3D 打印和冷凍成型工藝制備絲蛋白基骨組織工程支架，分析了純絲蛋白墨水和納米羥基磷灰石/絲蛋白混合墨水的流變行為，解析支架的分子結(jié)構(gòu)、微觀形貌和力學(xué)性能，為3D 制備生物相容性和力學(xué)性能優(yōu)異的骨組織工程支架提供了參考經(jīng)驗。

資料與方法

一、材料

桑蠶繭購自上海復(fù)向生物科技有限公司；甲醇（CH3OH）、乙醇（CH3CH2OH）購自北京現(xiàn)代東方科技發(fā)展有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3）購自Sigma-Aldrich 試劑公司；溴化鋰（LiBr）、納米羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］、透析袋（截留分子量MWCO 分別為3500、8 000-14 000 Da）、聚乙二醇（PEG，分子量為100 000）購自麥克林試劑公司。

二、方法

1. 再生絲蛋白溶液的制備：絲蛋白提取自桑蠶繭，絲蛋白溶液制備的操作步驟按照文獻［10］實驗流程。蠶繭塊在沸騰的0.02 M NaHCO3溶液中脫膠1 h，并用蒸餾水清洗。在45 ℃烘箱干燥后，將脫膠絲置于在9.3 M溴化鋰水溶液中，在40 ℃溶解30 min，所得溶液灌入透析袋（MWCO 8 000～14 000 Da）用蒸餾水透析3 d，換水12次以上，除去離子。所得絲蛋白水溶液以8 000 rpm 的速度離心15 min，去除不溶性雜質(zhì)，保留上層清液放在冰箱冷藏待用，7 d 內(nèi)使用。絲蛋白溶液的濃度標定采用稱重法。采用聚乙二醇溶液反透析的方法獲得高濃度絲蛋白溶液。將低濃度的純絲蛋白溶液倒入透析袋（MWCO～3 500），浸入質(zhì)量分數(shù)約為15 wt%的PEG 溶液（Mw～100 000）中，濃縮至目標濃度（13 ± 0.5）wt%、（15 ±0.5）wt%、（17 ± 0.5）wt%和（19 ± 0.5）wt%。

2. 冷凍支架定型液的制備：絲蛋白水凝膠墨水經(jīng)擠出后沉積在低溫平臺上冷凍成型，冷凍支架需經(jīng)過定型液的進一步處理，使絲蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變生成不溶的β-折疊構(gòu)象，從而固定支架形狀。采用的絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變誘導(dǎo)劑主要是醇類，定型液中組分的質(zhì)量配比為：80%甲醇、10%乙醇、10%去離子水。

3. 絲蛋白溶液流變性能測試：流變性能測試在DHR-2 流變儀上進行，采用室溫流動模式，剪切速率范圍為0.1～1 000 s-1，獲得絲蛋白墨水及絲蛋白/納米羥基磷灰石混合墨水的粘度-剪切速率曲線；采用室溫動態(tài)震蕩模式，頻率范圍為0.1～100 Hz，獲得墨水的模量-頻率曲線。

4. 絲蛋白支架的3D 打印制備：絲蛋白支架制備采用Fisnar 點膠機，配置低溫恒溫箱控制打印平臺溫度為-13 ℃。絲蛋白溶液經(jīng)過3 000 rpm 離心5 min 后，用膠頭滴管把中層均勻無氣泡的部分移進點膠機針筒，針頭直徑為0.21 mm。打印時，擠出壓力為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 bar，針頭移動速率為3、4、5、6 mm. s-1。打印程序由Roboedit 軟件設(shè)定，行間距為1 mm，90°正交打印形成16 行 × 16 列的20 層3D 支架，在平臺上冷凍成型。利用顯微鏡測量支架中橫縱向樣條尺寸，根據(jù)尺寸保真度優(yōu)選擠出壓力和打印速率打印參數(shù)。3D 支架打印及冷凍完成后，小心快速轉(zhuǎn)移到定型液中靜置5 min，誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變固定成型。定型3D 支架一部分浸泡在乙醇溶液中以濕態(tài)保存，另一部分經(jīng)冷凍干燥后以干態(tài)保存。

5. 絲蛋白/納米羥基磷灰石支架的制備：將5 g蔗糖溶于45 g 超純水配置質(zhì)量分數(shù)為10%的蔗糖溶液，加入1 g 納米羥基磷灰石，用磁轉(zhuǎn)子攪拌得到納米羥基磷灰石的蔗糖懸濁液。取150 g 低濃度初生絲蛋白水溶液與之混合，得到絲蛋白/納米羥基磷灰石混合墨水，采用聚乙二醇溶液反透析的方法獲得高濃度混合墨水，絲蛋白/納米羥基磷灰石復(fù)合支架的3D打印制備方法和定型方法同上。

6. 掃描電子顯微鏡表征：微觀形貌表征采用掃描電子顯微鏡，二次電子模式，加速電壓為20 kV。經(jīng)冷凍干燥的純絲蛋白3D 支架和絲蛋白/羥基磷灰石復(fù)合3D支架預(yù)先經(jīng)噴金處理。

7. 傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）表征：分子結(jié)構(gòu)表征采用傅立葉變換紅外光譜儀測試，在表面衰減全反射（attenuated total refraction，ATR）模式下，將樣條緊貼于ATR 晶體表面，采集純絲蛋白和復(fù)合兩種樣條的紅外光譜，波數(shù)范圍650～4 000 cm-1，累積掃描32次。FTIR樣品制備采用上述純絲蛋白以及絲蛋白/羥基磷灰石復(fù)合墨水，打印連續(xù)無間隙平板，經(jīng)過定型及冷凍干燥處理后，切成薄片試樣。利用Peakfit 軟件對吸收譜中的酰胺Ⅰ區(qū)進行高斯分峰擬合，設(shè)定小峰的半峰寬為5 cm-1，采用文獻［11］方法，根據(jù)峰中心位置判定構(gòu)象歸屬為Silk Ⅰ（包含無規(guī)線團、螺旋和β-轉(zhuǎn)角）、Silk Ⅱ（β-折疊）兩種，對各個擬合峰的面積進行匯總計算，獲得兩種構(gòu)象占比。

8. X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析晶型：使用D/MAX2200pc 型衍射儀，在10°～70°的2θ范圍內(nèi)，以6 °/min的掃描速率對支架樣品進行測試分析。XRD 測試樣品制備方式為：用刀片將制備的支架切下一片2 mm 左右厚度的片狀樣，將其壓制成致密的薄片，即可進行XRD測試分析。

9. 壓縮力學(xué)測試：壓縮力學(xué)測試在DMA Q800型動態(tài)熱機械分析儀上進行，將純絲蛋白3D 支架以及絲蛋白/羥基磷灰石復(fù)合3D 支架切割成橫截面為4 mm × 4 mm 的方柱樣品，置于壓縮夾具中，在0.01 N 預(yù)緊力下測試樣品高度（約為2 mm），壓縮時，壓縮應(yīng)變率速率為1%/min，壓縮應(yīng)變?yōu)?0%。壓縮彈性模量在所得壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線中，取1%～3%應(yīng)變段采用線性擬合獲得。每組測試5個樣品，壓縮彈性模量以均值表示。

結(jié) 果

一、純SF及nHAp/SF混合墨水的流變性能

純SF 和nHAp/SF 混合墨水的粘度-剪切速率關(guān)系即粘度隨著剪切速率的增加而下降，體現(xiàn)一定的剪切變稀行為。純SF 和SF/nHAp 混合墨水的粘度-剪切速率關(guān)系（圖1A），由于質(zhì)量濃度過高（＞17 wt%）的絲蛋白溶液在保存和進一步混合過程中極易發(fā)生自主凝膠化反應(yīng)，因此本研究選取了～15 wt%質(zhì)量分數(shù)的絲蛋白溶液作為純絲蛋白支架打印墨水。振蕩模式下，墨水的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）與頻率的關(guān)系曲線可看出，15 wt%絲蛋白溶液在<0.1 Hz 的低頻率下就發(fā)生從彈性固體到粘性液體的轉(zhuǎn)變，表明純絲蛋白溶液在較寬的動態(tài)剪切頻率范圍都可以進行擠出式3D打印（圖1B）。

圖1 A 絲蛋白質(zhì)量濃度為15%的SF和SF/nHAp墨水的粘度-剪切速率關(guān)系曲線 B 絲蛋白質(zhì)量濃度為15%的SF和SF/nHAp墨水的動態(tài)剪切模量G′/G″-頻率的關(guān)系曲線

二、nHAp/SF混合墨水的3D打印工藝

擠出式3D 打印的兩個重要工藝參數(shù)是擠出壓力和打印速率。為保證三維支架結(jié)構(gòu)的保真度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，需調(diào)節(jié)兩個參數(shù)使擠出單絲直徑控制在一個合適的范圍。打印平臺溫度設(shè)定為-13 ℃，SF/nHAp復(fù)合單絲直徑隨打印速率和擠出壓力的變化（圖2）。

圖2 nHAp/SF 混合墨水打印的纖維直徑-打印速率/擠出壓力關(guān)系圖 綠色表示單絲及支架結(jié)構(gòu)保真度高、打印效果好，紅色表示保真度低、打印效果差

三、SF支架及nHAp/SF支架的微觀形貌

冷凍成型的純絲蛋白3D 支架的截面顯示，每根圓形樣條中包含疏松多孔的結(jié)構(gòu)，放大后能看到片層結(jié)構(gòu)（圖3）。nHAp/SF 復(fù)合3D 支架表面放大之后能看到褶皺結(jié)構(gòu)和不均勻孔洞分布，截面形貌相對致密，放大之后能觀察到團聚的羥基磷灰石（圖4）。

圖3 15 wt% 純絲蛋白3D支架微觀形貌 A，B 純絲蛋白3D支架截面形貌 C～E 樣條表面形貌 圖4 A，B SF/nHAp復(fù)合3D支架截面形貌 C，D 樣條表面形貌 E 納米羥基磷灰石顆粒及團聚體形貌

四、SF及nHAp/SF支架的分子結(jié)構(gòu)

兩種絲蛋白3D支架在酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)、酰胺Ⅲ區(qū)出現(xiàn)了中心位于1 624 cm-1、1 526 cm-1、1 233 cm-1的吸收峰，對應(yīng)于β-折疊為主的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。XRD 圖顯示nHAp/SF 復(fù)合支架中雖然引入了羥基磷灰石，但羥基磷灰石的特征峰并不明顯，僅在2θ = 30°略高（圖5）。

圖5 傅里葉變換紅外光譜（ATR模式）檢測純絲蛋白及nHAp/SF 支架的吸收譜 A 15 wt%純絲蛋白支架的紅外光譜及酰胺Ⅰ區(qū)擬合曲線 B nHAp/SF復(fù)合支架的紅外光譜及酰胺Ⅰ區(qū)擬合曲線 C SF3D支架、nHAp/SF 3D支架、HAp粉末的XRD圖

五、SF及nHAp/SF支架的力學(xué)性能

壓縮模量根據(jù)所得壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線，取1%～3%應(yīng)變段采用線性擬合獲得。純絲蛋白3D 支架的壓縮模量為（331 ± 164） kPa，壓縮強度為（160 ±90） kPa。nHAp/SF復(fù)合3D支架的壓縮模量是（118 ±66） kPa，壓縮強度（120 ± 20） kPa，比純絲蛋白3D支架的模量和強度明顯更低（圖6）。

圖6 純絲蛋白支架及nHAP/SF 支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線 A 15 wt%絲蛋白支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線 B nHAp/SF 支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線

討 論

一、純SF及nHAp/SF混合墨水的流變性能

nHAp/SF 混合墨水的流變性能相比純SF 墨水發(fā)生了較大的變化，混合墨水的剪切變稀行為更加顯著，從低剪切速率下更高的粘度，迅速下降到了高剪切速率下的極低的粘度。一方面，納米顆粒的引入會增加高分子流動變形的阻力，提高墨水在低剪切速率下的粘度；另一方面，納米顆粒導(dǎo)致高分子鏈更容易纏繞、團聚，體現(xiàn)為粘度增加的效果。此外，研究表明HAp 中的Ca2+、PO43-與絲蛋白分子鏈上的酰胺基、氨基和羧基等基團產(chǎn)生靜電或共價作用，使混合墨水在低剪切速率下表現(xiàn)出更高的粘度［12］。本研究中nHAp/SF 混合墨水的初始模量明顯提升，在寬頻率范圍內(nèi)，均呈現(xiàn)G′＞G″的彈性固體性質(zhì)，當頻率＞1 Hz 時，才能達到粘性液體狀態(tài)。因此，混合墨水由于更高的粘度和更偏于固體的性質(zhì)，其擠出式3D 打印工藝上，相較純絲蛋白墨水不利于擠出但利于成型。

二、nHAp/SF混合墨水的3D打印工藝

研究發(fā)現(xiàn)由于擠出脹大效應(yīng)，單絲直徑比針頭直徑0.30 mm大，且隨打印速率增大而減少、隨擠出壓力增大而增大。對應(yīng)單絲直徑在0.30～0.40 mm適合打印的參數(shù)范圍是：打印速率4.0～4.5 mm/s，擠出壓力1.10～1.40 bar。

三、SF支架及nHAp/SF支架的微觀形貌

冷凍成型的純絲蛋白3D 支架的截面顯示，每根圓形樣條中包含疏松多孔的結(jié)構(gòu)，放大后能看到片層結(jié)構(gòu)，可能與冷凍成型溫度梯度有關(guān)。樣條表面是多孔片層結(jié)構(gòu)，孔洞大小不一，尺寸在幾微米到幾十微米之間。該形貌與文獻報道的絲蛋白水凝膠3D 支架的微觀形貌特征一致［13］。nHAp/SF 復(fù)合3D 支架的樣條表面形貌相比于純絲蛋白支架更加光滑平整，層狀結(jié)構(gòu)不再明顯，孔洞減少。

四、SF及nHAp/SF支架的分子結(jié)構(gòu)

通過分峰解析1 600～1 700 cm-1對應(yīng)的酰胺Ⅰ區(qū)吸收譜帶，可以獲得絲蛋白材料的構(gòu)象組成［11］。結(jié)果表明，復(fù)合支架中β-折疊構(gòu)象含量相對更高，推斷納米羥基磷灰石的引入可能促進了絲蛋白形成更多的β-折疊構(gòu)象。羥基磷灰石是天然骨組織里無機鹽的主要成分，其晶體屬于六方晶系，呈片層/針狀沿著Ⅰ型膠原蛋白c 軸層疊［14］。XRD圖中羥基磷灰石的特征峰并不明顯可能是由于納米羥基磷灰石過少信號被主體絲蛋白信號遮蓋。

五、SF及nHAp/SF支架的力學(xué)性能

3D支架的壓縮過程主要包括三個階段：線性粘彈區(qū)、恒應(yīng)力平臺、應(yīng)力急增區(qū)［15］。壓縮彈性模量根據(jù)所得壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線中，取1%～3%應(yīng)變段采用線性擬合獲得。本研究顯示純絲蛋白3D 支架的壓縮模量模量和強度相較以往報道的同等孔隙率的絲蛋白基支架更高，如Li 等［16］發(fā)現(xiàn)的SF/海藻酸鈉交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)支架的壓縮模量僅為16.0 kPa，另有人使用納米二氧化硅結(jié)構(gòu)增強的絲蛋白基支架的壓縮模量為283.5 kPa［17］。因此，本研究中制備的純絲蛋白3D 支架的壓縮力學(xué)性能較為優(yōu)異。引入羥基磷灰石會對支架的壓縮性能有提升，羥基磷灰石本身也是天然骨組織重要成分［18-20］。而本研究中的nHAp/SF 支架其絲蛋白含量遠低于15 wt%純絲蛋白支架，在絲蛋白形成交聯(lián)強化效果之前，低濃度的絲蛋白支架很難有優(yōu)異的壓縮性能，這個結(jié)果也表明高濃度的絲蛋白支架的確在力學(xué)性能上有很大的優(yōu)勢。

綜上，本研究采用擠出式3D 打印和冷凍成型工藝制備了純絲蛋白和nHAp/SF 3D 支架，并對墨水的流變性能、打印工藝參數(shù)、3D支架的微觀形貌、分子結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能進行了分析發(fā)現(xiàn)：（1）混合納米羥基磷灰石的絲蛋白墨水在低剪切速率條件下粘度更高，不利于擠出但有利于成型，剪切變稀行為更顯著；（2）nHAp/SF復(fù)合支架樣條表面形貌相比于純絲蛋白支架更加光滑平整；（3）純絲蛋白支架和復(fù)合支架的構(gòu)象結(jié)構(gòu)以β-折疊為主；（4）純絲蛋白3D 支架的壓縮性能較為優(yōu)異，復(fù)合支架的壓縮力學(xué)性能需要通過調(diào)控墨水比例和打印工藝進一步優(yōu)化。后續(xù)研究將聚焦nHAp/SF 支架的骨組織細胞相容性及體外促進成骨的效果。