毛智南 畢雪薇 舒雄 管娟

創(chuàng)傷、過(guò)度負(fù)荷、老化等原因造成的軟骨缺損是目前常見的臨床骨科疾?。?］。然而，軟骨缺乏血管、神經(jīng)和淋巴等組織，損傷后自我修復(fù)能力有限，會(huì)引起病患關(guān)節(jié)腫脹和不適，并導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎和整個(gè)關(guān)節(jié)的退行性病變［2-3］。盡管微骨折手術(shù)、自體軟骨細(xì)胞植入術(shù)及自體或異體軟骨組織移植術(shù)也在臨床上取得了一定的成效，但其長(zhǎng)期預(yù)后仍然存在較大不確定性及潛在風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。因此，有效治療關(guān)節(jié)軟骨損傷是急需解決的重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題，也是關(guān)系社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和民生的問(wèn)題。利用生物材料的策略有望成為軟骨組織再生和功能恢復(fù)的有效方法。理想的組織工程材料或支架應(yīng)該為細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的微環(huán)境，維持活細(xì)胞或生物活性分子的結(jié)構(gòu)和表型，促進(jìn)特定組織的細(xì)胞再生［6］。這要求支架具有合適的形態(tài)/孔徑、良好的生物相容性、降解性和降解過(guò)程的力學(xué)性能保持性［7-8］。對(duì)于支架的構(gòu)建，如果采用生物仿生的策略，除模仿天然軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)構(gòu)外，還應(yīng)當(dāng)模仿其力學(xué)特點(diǎn)（軟和彈），實(shí)現(xiàn)功能仿生，將會(huì)更好地促進(jìn)軟骨修復(fù)。軟骨細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入絲蛋白加明膠/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸復(fù)合支架上，并且動(dòng)態(tài)壓縮負(fù)荷模擬天然軟骨力學(xué)微環(huán)境，軟骨基質(zhì)產(chǎn)物即蛋白聚糖和二型膠原明顯上調(diào)形成新的軟骨組織［9］。因此，具有仿生力學(xué)性能的工程軟骨支架有利于軟骨基質(zhì)的形成。絲蛋白（silk fibroin，SF）作為一種天然高分子材料具有綠色來(lái)源、生物降解速率可控、生物相容性好、力學(xué)性能可調(diào)等特點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛應(yīng)用［10-11］。此外，SF 及其降解產(chǎn)物在體內(nèi)不會(huì)引起炎癥反應(yīng)［12］。目前，軟骨組織工程支架的加工技術(shù)包括冷凍干燥、靜電紡絲、3D 打印和鹽浸法等，但制備的SF支架很少具備仿生軟骨的力學(xué)性能，且降解過(guò)程中過(guò)快喪失力學(xué)穩(wěn)定性，無(wú)法為細(xì)胞增殖和組織再生提供穩(wěn)定的微環(huán)境。利用低溫冷凍凝膠技術(shù)制備了具有高彈性且均勻孔結(jié)構(gòu)的SF 多孔材料［13-14］。有研究利用該技術(shù)制備了具有優(yōu)異生物相容性的物理化學(xué)雙交聯(lián)SF 多孔支架［15-16］。但是，該SF 支架在降解過(guò)程中是否能維持力學(xué)穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步觀察。本研究利用低溫冷凍凝膠法，即在凝膠體系中引入化學(xué)交聯(lián)劑，制備了化學(xué)和物理雙交聯(lián)的SF 軟骨支架。本研究旨在對(duì)支架的微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能（包括降解前和降解過(guò)程中）及支架的體內(nèi)組織相容性和軟骨缺損修復(fù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

資料與方法

一、資料

1. 材料和器材：桑蠶繭購(gòu)買于上海復(fù)向科技有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3），溴化鋰（LiBr），乙二醇二縮水甘油醚（EGDE），四甲基乙二胺（TEMED），聚乙二醇（PEG，分子量為100 000），透析袋（截留分子量分別為3 500、8 000-14 000），蛋白酶（XIV 型來(lái)自灰色鏈霉菌），磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購(gòu)買于Sigma，美國(guó)。掃描電鏡（SEM，S-4800，日本Hitachi 公司）、動(dòng)態(tài)機(jī)械分析儀（DMA Q800，美國(guó)）。使用的動(dòng)物購(gòu)自積水潭動(dòng)物管理中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)積水潭醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南（國(guó)家科學(xué)院出版社，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院） 85-23 號(hào)出版物，1996 年修訂）。

2. 絲蛋白溶液的制備：SF 提取自桑蠶繭，實(shí)驗(yàn)流程按照前期研究進(jìn)行［17］。將桑蠶繭在沸騰的0.02 M NaHCO3溶液中煮1 h，脫去蠶絲表面絲膠；然后在超純水中洗滌5次并干燥。將所得的干態(tài)脫膠蠶絲溶解在9.3 M LiBr 溶液中，在40 ℃下溶解3 h；隨后將絲蛋白溶液在去離子水中透析3 d（MWCO 8 000-14 000 Da）；每天更換3 次去離子水以去除溶液中的離子；最后通過(guò)離心再次去除雜質(zhì)。最終利用質(zhì)量法確定絲蛋白溶液的濃度，即稱量已知體積的溶液（n= 3）；再稱量干燥后溶質(zhì)的質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算絲蛋白的質(zhì)量體積濃度。

3. 絲蛋白冷凍凝膠支架的制備：將濃度為5.5%w/v 的SF 溶液與TEMED 催化劑（0.25 v/v%）和交聯(lián)劑EGDE（1 mmol/g）混合，體積定容在3.2 ml。TEMED 加入的量以溶液總體積的比例加入。EGDE 加入的方式為相對(duì)于SF 溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量比例引入，含量表示為mmol/g。將反應(yīng)溶液攪拌30 min，使溶液充分混合。隨后將反應(yīng)溶液放入溫度為-10 ℃的恒溫反應(yīng)器中進(jìn)行24 h 凝膠反應(yīng)，得到冷凍凝膠支架。將該冷凍凝膠解凍12 h。最后通過(guò)冷凍干燥得到SF 多孔支架。含交聯(lián)劑和催化劑的SF 支架命名為SF-1E0.25T；純SF 支架命名為SF-0E0T。

二、方法

1. 掃描電子顯微鏡檢查：用刀片將試樣切成2 ～ 3 mm 厚且平整的樣品。利用導(dǎo)電膠將樣品貼在樣品臺(tái)上，隨后濺射噴金120 s。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察材料的表面形貌和孔徑尺寸。

2. 壓縮力學(xué)性能檢測(cè)：壓縮試驗(yàn)在動(dòng)態(tài)機(jī)械分析儀上選取準(zhǔn)靜態(tài)模式進(jìn)行。試樣大小為7.5 mm ×5 mm（直徑 × 高度），測(cè)試前試樣在PBS 中浸泡12 h以達(dá)到平衡。壓縮應(yīng)變速率為30%/min。壓縮楊氏模量在試驗(yàn)初始應(yīng)變階段（3%～5%）計(jì)算。

3. 降解后力學(xué)保持性測(cè)試：使用酶降解法評(píng)估SF 支架的力學(xué)穩(wěn)定性。先配制1 U/ml 的蛋白酶［XIV 型來(lái)自灰色鏈霉菌（3.5 U/mg）］，將大小為7.5 mm × 3 mm（直徑×厚度）的SF 支架置于1 ml 酶溶液中. 每3 天更換1 次酶溶液。在7、14、21、28 d后取出降解樣品并用去離子水洗滌除去殘留的降解液。隨后進(jìn)行壓縮力學(xué)性能測(cè)試，壓縮楊氏模量取試驗(yàn)初始應(yīng)變階段（3%～5%）計(jì)算。

4. 支架的大鼠皮下組織相容性評(píng)價(jià)：將體重為250～300 g 的Sprague-Dawley（SD）大鼠用于評(píng)估SF支架在皮下植入模型的體內(nèi)生物相容性。所有動(dòng)物程序均按照《北京航空航天大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)北京航空航天大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BM20180041）。麻醉后，將SF-1E0.25T支架植入大鼠皮下。支架在植入前進(jìn)行滅菌處理并浸泡在無(wú)菌PBS 溶液中。植入的SF 支架尺寸為7.5 mm × 1.5 mm（直徑×厚度），用于觀察異物反應(yīng)（foreign body reaction， FBR）。在手術(shù)后第28 天處死動(dòng)物。收集樣品和鄰近組織用于以下組織學(xué)研究。對(duì)于組織學(xué)檢查，樣品首先用10%中性緩沖福爾馬林固定，然后經(jīng)脫水、浸蠟處理后包埋在石蠟中。隨后將4 μm 厚石蠟切片用蘇木精和伊紅（HE）和Masson三色染色以評(píng)估FBR。

5. 支架的兔子膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)評(píng)價(jià)：將SF-1E0.25T 支架植入兔子膝關(guān)節(jié)軟骨缺損部位，驗(yàn)證支架體內(nèi)原位軟骨缺損修復(fù)的能力。體重為2.7～3.2 kg的成年雄性新西蘭白兔用于體內(nèi)研究。兔子經(jīng)過(guò)麻醉、常規(guī)準(zhǔn)備和造模，制備標(biāo)準(zhǔn)微骨折，然后植入SF-1E0.25T 支架與缺損相匹配。其中部分微骨折組（MF）作為對(duì)照組，最后縫合關(guān)節(jié)。12 周后，處死兔子進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)研究。組織學(xué)標(biāo)本用4%多聚甲醛（pH 7.4）中固定48 h，然后在20% EDTA（pH 7.2）中脫鈣2 個(gè)月。脫鈣標(biāo)本在分級(jí)乙醇中脫水，并包埋在石蠟中，連續(xù)切片（6 mm厚），最后進(jìn)行HE、番紅固綠染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。各組間采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．SF 軟骨支架的形貌和力學(xué)特性：純絲蛋白支架和物理化學(xué)雙交聯(lián)絲蛋白支架的微觀形貌顯示，SF-1E0.25T支架的微孔更加均勻（圖1）。

圖1 微觀形貌表征 A SF-0E0T 支架的微觀形貌 B SF-1E0.25T支架的微觀形貌

2.SF軟骨支架在降解過(guò)程中的力學(xué)性能變化：對(duì)SF-0E0T 和SF-1E0.25T 進(jìn)行了壓縮性能測(cè)試顯示，降解前SF-0E0T 支架的壓縮模量要高于SF-1E0.25T。但濕態(tài)下的加載-卸載過(guò)程中SF-1E0.25T 支架表現(xiàn)出更好的彈性（圖2）。在PBS（pH = 7.4， 37 ℃）條件下，使用濃度為1 U/ml 的蛋白酶XIV溶液對(duì)2種支架進(jìn)行體外降解觀察。第7、14、21、28 天對(duì)支架的壓縮力學(xué)性能進(jìn)行了測(cè)試顯示，SF-1E0.25T 支架的壓縮模量從開始的40 kPa 逐漸降到第28 天的8 kPa 左右。與此對(duì)應(yīng)的是，SF-0E0T 在降解第7 天后已經(jīng)無(wú)法進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試（圖2，3）。

圖2 支架的力學(xué)性能表征 A SF-0E0T和SF-1E0.25T支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線 B SF-0E0T和SF-1E0.25T支架的壓縮模量統(tǒng)計(jì) C SF-0E0T和SF-1E0.25T濕態(tài)支架受壓后自主恢復(fù)原始狀態(tài)的示意圖

圖3 SF軟骨支架降解過(guò)程的力學(xué)性能表征 A SF-1E0.25T支架不同降解時(shí)間后（第7、14、21和28天）的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線 B SF-1E0.25T支架不同時(shí)間后的壓縮模量統(tǒng)計(jì)

3. SF 軟骨支架的組織相容性：將SF-1E0.25T支架植入大鼠皮下，植入28 d 后組織學(xué)分析顯示，周圍組織中的細(xì)胞已經(jīng)充分浸潤(rùn)到支架內(nèi)部，支架內(nèi)部也生成了新的再生組織，充分體現(xiàn)了支架與組織之間的融合。從Masson 組織染色結(jié)果可以看出，支架與周圍組織界面處并未形成纖維囊，說(shuō)明了支架在體內(nèi)不會(huì)引起慢性炎癥反應(yīng)（圖4）。

圖4 SF-1E0.25T 支架大鼠皮下組織學(xué)分析 A 植入28 d 后H&E染色圖像 B 植入28 d后Masson染色圖像。“S”代表支架；虛線代表支架與周圍組織的界面；箭頭代表支架內(nèi)的再生組織

4. SF 軟骨支架的體內(nèi)軟骨再生能力：將SF-1E0.25T 支架植入兔子軟骨缺損模型中經(jīng)過(guò)12 周的飼養(yǎng)，對(duì)軟骨修復(fù)效果顯示，MF 組基本無(wú)新透明軟骨生成；相反SF-1E0.25T組軟骨缺損處（紅線內(nèi)）有再生透明軟骨生成，相比于其他無(wú)添加生物活性因子材料原位軟骨再生也體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)［18-19］。采用H&E 和番紅固綠染色對(duì)SF-1E0.25T 組缺損部位和再生軟骨組織進(jìn)行檢測(cè)顯示，軟骨缺損部位生成了新的軟骨組織，并且與周圍軟骨組織整合很好，軟骨基質(zhì)成分含有糖胺聚糖（圖5）。

圖5 原位軟骨修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) A 植入12周后MF 組大體觀照片 B 植入12 周后SF-1E0.25T 組大體觀照片 C 植入12 周后SF-1E0.25T組的組織學(xué)評(píng)價(jià)（HE和番紅固綠染色）。第一個(gè)箭頭代表再生軟骨與天然軟骨的界面處；第二個(gè)箭頭代表軟骨基質(zhì)

討 論

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)和淋巴管等組織，導(dǎo)致其損傷后自愈能力有限［2-3］。因此，如何有效治療關(guān)節(jié)軟骨損傷一直是醫(yī)學(xué)上的難題之一。關(guān)節(jié)軟骨具有復(fù)雜的層級(jí)結(jié)構(gòu)，大約1～2 mm 厚，覆蓋在關(guān)節(jié)骨表面；其水分含量很高且表面光滑可以起到緩沖應(yīng)力、降低摩擦、承受復(fù)雜載荷的作用；軟骨組織在服役過(guò)程中須保持一定的力學(xué)穩(wěn)定性。對(duì)于無(wú)負(fù)載生物活性因子的SF 軟骨支架可以一定程度實(shí)現(xiàn)軟骨的再生和修復(fù)［20］，但該支架在服役過(guò)程中的力學(xué)穩(wěn)定性及與軟骨新基質(zhì)形成之間的聯(lián)系值得進(jìn)一步探索。

相關(guān)研究表明均勻三維空間結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的增殖和分化，也有利于組織再生過(guò)程中ECM 的產(chǎn)生［21］。因此，本研究利用冷凍凝膠策略構(gòu)建的SF多孔支架滿足組織工程應(yīng)用的基本性能要求，同時(shí)SF支架形變可以完全恢復(fù)到原始狀態(tài)，基本實(shí)現(xiàn)了軟骨力學(xué)仿生的目的。同時(shí)，該力學(xué)性能特點(diǎn)也優(yōu)于現(xiàn)有部分的軟骨組織支架［18，22-23］。SF 作為一種天然蛋白質(zhì)材料，在蛋白酶的條件下可以發(fā)生降解。SF-1E0.25T 支架在降解過(guò)程壓縮模量呈現(xiàn)出接近線性衰減的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分體現(xiàn)了雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的SF軟骨支架具有更高的力學(xué)穩(wěn)定性，力學(xué)性能降低更可控。

生物材料植入宿主體內(nèi)會(huì)引起異物反應(yīng)，包括宿主細(xì)胞最初聚集，隨后組織長(zhǎng)入、生物材料降解或在植入后期生物材料周圍形成纖維囊［24］。從材料與組織界面處是否形成膠原纖維囊，可以評(píng)價(jià)材料在體內(nèi)是否可以穩(wěn)定存在，即是否會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)。綜合以上組織學(xué)評(píng)價(jià)，表明該SF-1E0.25T支架在體內(nèi)呈現(xiàn)出優(yōu)異的組織相容性。兔子軟骨缺損模型的組織學(xué)結(jié)果表明，在無(wú)生物活性因子的輔助下，SF支架依然具有一定的軟骨修復(fù)能力。故推測(cè)該效果與SF 軟骨支架在降解過(guò)程可以保持穩(wěn)定的力學(xué)性能有關(guān)，為新軟骨基質(zhì)不斷的形成提供了良好的微環(huán)境。在未來(lái)的工作中有待更深入分析支架力學(xué)與軟骨修復(fù)效果之間的關(guān)系，為無(wú)生物活性因子、無(wú)外源細(xì)胞的生物材料實(shí)現(xiàn)軟骨修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

本研究探索了雙交聯(lián)SF 軟骨支架在體外降解過(guò)程的力學(xué)特性維持能力，并且采用大鼠皮下植入模型和兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，嘗試建立仿生力學(xué)性能與軟骨修復(fù)效果之間的聯(lián)系。相比于純SF 支架，SF-1E0.25T 支架在降解過(guò)程中，力學(xué)性能呈現(xiàn)出近線性衰減的趨勢(shì)，為內(nèi)源細(xì)胞生長(zhǎng)和新軟骨基質(zhì)的形成提供穩(wěn)定的微環(huán)境。同時(shí)該支架在大鼠皮下呈現(xiàn)出優(yōu)異的組織相容性，無(wú)明顯的異物反應(yīng)。兔軟骨缺損實(shí)驗(yàn)表明具有仿生力學(xué)性能的SF 軟骨支架可以一定程度實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的再生和修復(fù)。

志謝該研究工作得到了北京市屬醫(yī)學(xué)科研院所公益發(fā)展改革與試點(diǎn)項(xiàng)目（京醫(yī)研2019-9）資助。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由北京航空航天大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)（北京100083）和北京積水潭醫(yī)院（北京100035）批準(zhǔn)（202110-02）。

利益競(jìng)爭(zhēng)聲明作者聲明，他們沒(méi)有已知的可能影響本文所述工作的相互競(jìng)爭(zhēng)的經(jīng)濟(jì)利益或個(gè)人關(guān)系。