陳磊 鄭蕊 杰永生 綦惠 舒雄

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)相鄰兩骨之間發(fā)揮潤(rùn)滑和減震作用的結(jié)締組織，健康的關(guān)節(jié)軟骨是人體正常活動(dòng)的基本條件。然而，關(guān)節(jié)軟骨具有細(xì)胞數(shù)量少以及缺乏血管、神經(jīng)和淋巴管的生理特點(diǎn)，損傷后自我修復(fù)過(guò)程緩慢，完全修復(fù)難［1-3］。針對(duì)軟骨自修復(fù)能力弱的問(wèn)題，研究者們探索了諸多治療方法，其中包括關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)、微骨折或骨髓刺激、自體軟骨細(xì)胞移植、自體或者同種異體移植物等手段［4-7］。但是，這些手段僅僅較短期緩解軟骨病變進(jìn)了一步，仍然沒(méi)有達(dá)到理想的修復(fù)效果。

近些年，隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和成熟，為軟骨的有效簡(jiǎn)便修復(fù)和再生帶來(lái)了新的希望。軟骨組織工程三要素包括種子細(xì)胞、支架材料和生物活性分子［8］。支架材料是軟骨組織工程中十分重要的一部分，適合的支架材料對(duì)于軟骨損傷的治療非常關(guān)鍵。用于軟骨損傷治療的支架材料不僅應(yīng)具有合適的機(jī)械性能，還應(yīng)具有優(yōu)異的生物相容性和有效的組織整合性，有利于細(xì)胞黏位、增殖和表型維持，從而促進(jìn)新生組織形成［9］。目前已應(yīng)用于骨軟骨修復(fù)支架的材料包括多種天然和合成的高分子材料，如固體多孔支架、纖維支架和水凝膠等［10］。膠原蛋白是人體各種結(jié)締組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在活體結(jié)締組織中所占比例很高，并且易于從組織中提取和純化，因此已被用于制備多種類型的生物材料。膠原蛋白材料具有許多優(yōu)勢(shì)，例如良好的生物相容性、可生物降解性、仿生性和高度通用性。然而，僅就在軟骨組織工程中的應(yīng)用而言，純膠原蛋白往往自身力學(xué)性能不足，因而通常與其他聚合物混合使用［11］。桑蠶絲是一種具有優(yōu)異的力學(xué)性能以及良好的生物相容性、可加工性和生物降解性的天然高分子生物材料，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［12］。絲素含量的增加可改善膠原的強(qiáng)度；在以絲素蛋白為基礎(chǔ)的支架中加入膠原蛋白，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成軟骨化和軟骨基質(zhì)的生成。

本研究選用絲素蛋白和膠原為材料，運(yùn)用化學(xué)交聯(lián)和冷凍干燥等技術(shù)，制備高度仿生性骨軟骨結(jié)構(gòu)支架，并對(duì)其理化性能及生物相容性進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，構(gòu)建骨軟骨缺損修復(fù)的復(fù)合支架材料。

資料與方法

一、資料

1．材料和試劑：新鮮的牛跟腱，家蠶繭，胃蛋白酶，胰酶，高糖DMEM，低糖DMEM 和胎牛血清（FBS）［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，美國(guó)］，N-羥基丁二酰亞胺（NHS），1-乙基（3-二甲氨基丙基）-3-碳二亞胺（EDAC），噻唑藍(lán)（MTT），氯化鈉，無(wú)水乙酸，甲醛，I 型膠原酶和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料，二甲基亞砜（DMSO）（Sigma 公司，美國(guó)），蔗糖（北京溪洋匯智科技有限公司，中國(guó)）。

2．儀器和設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，美國(guó)］，往復(fù)式真空泵（上海益化真空設(shè)備有限公司），真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)SP科學(xué)公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡［奧林巴斯（中國(guó)）有限公司，日本］，動(dòng)態(tài)力學(xué)分析儀［沃特世科技（上海）有限公司，美國(guó)］），掃描電鏡［日立（中國(guó)）有限公司，日本］。

二、方法

1. 膠原蛋白的制備：牛跟腱去除筋膜、肌肉和脂肪，用切片機(jī)和組織攪拌機(jī)充分粉碎。用濃度為0.1～0.2 mol/L NaOH 攪拌6～8 h 以去除雜蛋白。蒸餾水洗牛跟腱碎粒，調(diào)節(jié)pH 值至中性；用75%乙醇攪拌脫脂1 h，用蒸餾水清洗，調(diào)節(jié)pH 值至中性。將牛跟腱碎粒溶解在0.5 mol/L醋酸溶液中，質(zhì)量體積比為1%。牛跟腱碎粒與胃蛋白酶的質(zhì)量比為50∶1，在4℃下攪拌60 h［13］。上述混合液1 200 rpm離心，收集上清液。上清液以10 mol/L NaOH 溶液調(diào)整pH=5.5，之后1 200 rpm 離心收集膠原沉淀。用0.5 mol/L 的醋酸溶解膠原沉淀，然后用2 倍體積的超純水水洗離心沉淀，得到膠原溶液。

2. 絲素蛋白的制備：配置0.5%的NaHCO3水溶液并煮沸，將蠶繭置于NaHCO3沸水溶液中脫膠60 min 以除去其表面的絲膠蛋白。將脫膠后的再生絲蛋白纖維以去離子水清洗后烘干密封保存。配置CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩爾比1∶2∶8）三元溶液。于（72 ± 2）℃下在三元溶液中磁力攪拌再生絲蛋白纖維，浴比1∶10，時(shí)間1 h，得到混合溶液。將絲素溶液裝入透析袋（截留分子量為8 000～14 000 D）中，在流動(dòng)的自來(lái)水中透析48 h，之后換去離子水，換水1 次/h，持續(xù)48 h，經(jīng)過(guò)透析，過(guò)濾得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0 wt%～3.5 wt%絲素蛋白溶液。

3. 絲素蛋白、膠原和絲素蛋白 - 膠原3 種支架的制備：采用新鮮制備的膠原和絲素蛋白冷凍干燥制備膠原和絲素蛋白支架。按照質(zhì)量比7∶3進(jìn)行混合，攪拌均勻后裝入透析袋中，以5倍體積蔗糖濃縮6 h，用手持微量電動(dòng)攪拌器混勻不同比例的膠原和絲蛋白，超聲振動(dòng)20 min 除氣泡。材料鋪板，凍干。將3種支架用50 mmol EDAC和20 mmol的NHS溶于95%乙醇中，4 ℃靜置24 h，進(jìn)行交聯(lián)，以PBS緩沖液和去離子水清洗3遍，冷凍干燥，60Co-γ輻照滅菌。

4. 絲素蛋白 - 膠原支架的結(jié)構(gòu)特征觀察：（1）掃描電鏡觀察：將骨軟骨一體化雙相支架的每層于水平面和垂直面切開(kāi)，并固定于鋁質(zhì)底座上，進(jìn)行離子濺射噴金，在加速電壓下進(jìn)行掃描電鏡觀察。（2）骨軟骨一體化支架溶脹率測(cè)定：冷凍干燥支架稱取質(zhì)量為干重（Wd），然后在12 h 內(nèi)浸入37 ℃的PBS（pH = 7.4）緩沖液，分別取出支架稱取質(zhì)量稱為濕重（Ws）（n= 3）。支架溶脹率計(jì)算如下：（Ws-Wd）/Wd × 100%。（3）采用Micro-CT測(cè)定支架的結(jié)構(gòu)孔徑。

5. 力學(xué)測(cè)試：將凍干后3種支架制備直徑6 mm、高6 mm 圓柱體，支架樣本處于完全濕潤(rùn)狀態(tài)，支架在室溫下浸泡于去離子水，至測(cè)試時(shí)取出。將樣本置于定制的上下兩層剛性?shī)A板之間，應(yīng)用DMAQ800試驗(yàn)機(jī)，最大應(yīng)變至20%時(shí)停止。記錄相關(guān)測(cè)試數(shù)據(jù)并自動(dòng)輸出，根據(jù)應(yīng)力 - 應(yīng)變曲線的線性變化部分計(jì)算相應(yīng)的壓縮模量。彈性模量檢測(cè)：將3 種支架固定于DMAQ800 試驗(yàn)機(jī)上下兩層夾板間，以0.01 mm/s的恒定拉伸速度進(jìn)行位移控制，以雙層界面各自分離為極限拉伸強(qiáng)度，最終測(cè)定其彈性模量。

6. 細(xì)胞毒性檢測(cè)：支架浸提液制備，根據(jù)表面積與體積比計(jì)算出DMEM 培養(yǎng)液量。在37 ℃溫箱孵育24 h 后，取上清液過(guò)濾，即為支架浸提液。取L929 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)其貼壁與生長(zhǎng)，24 h 后胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，每孔100 μL，細(xì)胞濃度（4 × 107）/L 鋪板，每組3孔。之后將原培養(yǎng)液倒掉，以含有支架浸提液的96 孔板的L929 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照組。培養(yǎng)2、4 和7 d，棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT液于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h后每孔加入150 μL DMSO，震蕩后通過(guò)酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定吸光度值（A值）。

7. 活（死）細(xì)胞染色：將P3 代小鼠軟骨細(xì)胞種植到支架上，每塊支架種植大約7 × 106個(gè)細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞 - 支架復(fù)合體，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)3，5，7 d后，取出在避光條件下進(jìn)行死（活）細(xì)胞染色，無(wú)菌PBS 溶液清洗2 次，加入DAPI 孵育5 min，PBS 清洗2次，然后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 10.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分 析。計(jì) 量 數(shù) 據(jù) 以±s表 示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、絲素蛋白 - 膠原支架的結(jié)構(gòu)特征

采用交聯(lián)和冷凍干燥技術(shù)成功制備新型的絲素蛋白 - 膠原支架（圖1A，B）。支架內(nèi)呈縱向平行疏松的孔道結(jié)構(gòu)（圖1C）；橫切面呈多孔網(wǎng)狀，內(nèi)部有良好的孔隙（圖1D）。

圖1 絲素蛋白 - 膠原支架的形貌和結(jié)構(gòu)特征 A 橫向大體觀 B 縱向大體觀 C 縱切面 D 橫切面

二、絲素蛋白 - 膠原支架的物理化學(xué)特性

支架材料內(nèi)部的孔徑和分布對(duì)于軟骨組織工程是重要條件。膠原支架和絲素蛋白支架孔徑分別為（121.6 ± 8.6）μm 和（98.4 ± 5.6）μm；絲素蛋白 - 膠原支架孔徑為（103.2 ± 3.9）μm，利于細(xì)胞培養(yǎng)（圖2A）。采用溶脹平衡測(cè)定法對(duì)3 種凍干支架的溶脹率進(jìn)行測(cè)定，即在相同時(shí)間內(nèi)吸收PBS 緩沖液，30 min 內(nèi)達(dá)到吸收逐漸平衡。較大的孔徑和較高的多孔性可使支架有更多的儲(chǔ)水空間，吸水率增加（圖2B）。

圖2 膠原支架、絲素蛋白支架和絲素蛋白 - 膠原支架的物理化學(xué)特性 A 孔徑大小 B 溶脹率

三、絲素蛋白 - 膠原支架的生物力學(xué)性能

支架優(yōu)良的生物力學(xué)性能對(duì)軟骨缺損修復(fù)有重要作用。膠原支架、絲素蛋白支架和絲素蛋白 - 膠原支架的壓縮模量分別為（67.6 ± 2.9）、（140.7 ±2.5）和（94.3 ± 5.2）kPa（圖3A），彈性模量分別為（13.3 ± 1.6）、（29.9 ± 2.2）和（22.9 ± 3.0）kPa（圖3B）。

圖3 膠原支架、絲素蛋白支架和絲素蛋白 - 膠原支架的力學(xué)性能 A 壓縮模量 B 彈性模量

四、絲素蛋白 - 膠原支架的體外生物相容性

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組L929細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，各觀察時(shí)間點(diǎn)兩組A 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞ 0.05）（圖4A），表明支架材料無(wú)細(xì)胞毒性。采用絲素蛋白 - 膠原支架培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)3，5，7 d 后進(jìn)行DAPI 染色，熒光顯微鏡下可見(jiàn)軟骨細(xì)胞增殖（圖4B～D），提示支架上有良好的細(xì)胞附著和生長(zhǎng)。

圖4 絲素蛋白 - 膠原支架的生物相容性測(cè)定 A MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒 B～D 軟骨細(xì)胞在絲素蛋白 - 膠原支架的增殖

討 論

軟骨自身修復(fù)能力較差，損傷后的再生受到限制。 軟骨缺損后不能恢復(fù)其原有組織和功能，可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。因此，受損關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)是非常重要的。隨著生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，多學(xué)科交叉融合的組織工程技術(shù)為諸多臨床疾病的治療提供了重要手段，同時(shí)為軟骨損傷的治愈帶來(lái)了希望［10，14-15］。

本研究構(gòu)建了脫細(xì)胞絲素蛋白 - 膠原支架。其中絲素蛋白骨架主要由兩種蛋白質(zhì)組成，即外層包衣蛋白絲膠和內(nèi)層蛋白絲素。許多研究結(jié)果表明，具有不同結(jié)構(gòu)的絲素蛋白不僅具有可調(diào)的降解速率和力學(xué)性能，而且具有良好的生物相容性［16］。膠原蛋白顯示出良好的生物相容性，同時(shí)具有較低的免疫原性、細(xì)胞粘附性和適當(dāng)?shù)纳锝到庑裕?7］。膠原與生物分子的相互作用可促進(jìn)種子細(xì)胞向支架內(nèi)生長(zhǎng)。膠原的加入可使復(fù)合支架具有較絲素蛋白支架更強(qiáng)的生物相容性和更好的細(xì)胞增殖能力［18］。Ghezzi 等［19］用逐層法制備了致密的膠原 -絲素靜電紡絲支架，并將間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）接種到支架上，對(duì)MSCs 的生長(zhǎng)和成軟骨細(xì)胞的分化進(jìn)行了比較；結(jié)果表明，可能是由于絲素含量的增加，改善了膠原較差的強(qiáng)度。另一方面，在以絲素蛋白為基礎(chǔ)的支架中加入膠原蛋白，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成軟骨化，并促進(jìn)軟骨基質(zhì)的生成［20-21］。本研究通過(guò)對(duì)3 種支架的細(xì)胞毒和活（死）細(xì)胞染色進(jìn)行檢測(cè)，確定絲素蛋白 - 膠原支架具有良好的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)種子細(xì)胞與周?chē)＝M織細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)效果好。通過(guò)掃描電鏡觀察可見(jiàn)，支架內(nèi)軟骨層內(nèi)孔隙間連通性良好，同時(shí)骨層有較高的孔隙率與相對(duì)較大的孔徑，因此利于組織內(nèi)細(xì)胞間氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，同時(shí)其力學(xué)性能尤佳，冷凍干燥的力學(xué)性能與吸水能力表現(xiàn)均衡。此外，MTT 檢測(cè)和熒光染色結(jié)果表明新型絲素蛋白 - 膠原支架有良好的細(xì)胞相容性。

本研究作為體外實(shí)驗(yàn)的前期研究，難以模擬動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨復(fù)雜的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，無(wú)法獲得新型絲素蛋白 - 膠原支架被植入動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)軟骨修復(fù)再生的作用。

綜上所述，新型絲素蛋白 - 膠原支架的制備是可行的，且該支架具有良好的生物相容性和力學(xué)特性。新型絲素蛋白 - 膠原支架在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)骨軟骨缺損的修復(fù)和再生作用，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。