歐陽秦君 劉曉嬌 蔡國龍 姚響 張耀鵬

脫膠蠶絲因具有來源廣泛、生物相容性和力學性能優(yōu)異、低免疫原性和可生物降解等特性，在臨床手術縫合線、傳統(tǒng)的化妝品和個人護理等領域已有數(shù)百年的應用歷史［1-3］。近年來，基于其優(yōu)異的綜合性能，亦逐漸探索其在肌腱、韌帶等組織工程領域中的應用。但眾多研究還體現(xiàn)出絲素蛋白材料的生物活性和生物功能性有待進一步提升的空間［4-5］。為了進一步提升脫膠蠶絲等類似纖維材料的生物功能性，當前大多數(shù)研究采用負載生物活性成分（抗菌劑、活性生物因子等）的方法［6-9］。相較而言，如何通過類似纖維材料的表界面圖案化改性提升脫膠蠶絲的細胞黏附和增殖等生物功能性則未見研究報道。在其他類型的材料領域，尤其是二維膜材表面，已有大量研究證實材料表面的適宜納米拓撲結構形貌能顯著調控細胞行為［10-12］，比如增強細胞的黏附、增殖和誘導定向分化的潛力。本研究旨在探索利用便捷的空氣等離子體刻蝕技術對脫膠蠶絲表面進行有效的納米圖案化修飾，并借助掃描電子顯微鏡、高靈敏度動態(tài)力學疲勞試驗機綜合表征相關脫膠蠶絲表面的納米圖案特征及單絲力學性能變化，以期進一步選用大鼠骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells， BMSCs）為模型細胞，深入研究納米圖案化修飾對干細胞黏附和增殖的影響。

資料與方法

一、資料

1. 材料和器材：主要材料包括桑蠶繭（浙江桐鄉(xiāng)）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）試劑盒（Dow chemical，美國）；環(huán)氧樹脂AB 膠（得力集團有限公司）；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco，美國）；Cell counting kit-8（CCK-8）試劑盒（MCE，美國）；碳酸氫鈉（NaHCO3）、無水乙醇、叔丁醇、二甲基亞砜（DMSO）（國藥集團化學試劑有限公司，中國）；多聚甲醛（安徽白鯊生物科技有限公司）；大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）（上海賽箔生物科技有限公司）。主要儀器包括等離子體處理儀（SY-DT01，奧普斯等離子體科技有限公司）、掃描電鏡（SEM，S-4800，日本Hitachi 公司）、動態(tài)力學疲勞試驗機（Electro Force 3230，美國TA 儀器公司）、酶標儀（Multiskan FC，美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2. 脫膠蠶絲的制備：先將桑蠶繭置于95 ℃的去離子水中煮1 min，后轉移至室溫的去離子水中泡1 min，重復3 次，使蠶絲舒展開來。再將舒展開的蠶繭置于87 ℃的 NaHCO3溶液中煮15 min（溶液濃度為0.02 M），使其進一步脫膠和舒展。最后理出頭絲，將其均勻地纏繞在定制的聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）架子上。架子長26 mm、寬22 mm、高6 mm，中間鏤空。脫膠蠶絲連續(xù)纏繞于架子上，絲的開始端和收尾端均用具有良好生物相容性的PDMS 進行粘接固定，纖維整體上接近平行排布特征。其中每個架子（樣本）上纏繞的脫膠絲總長相當（均纏繞250圈）。將此步驟制備好的樣本命名為non-etched silk（NE silk）。

二、方法

1. 脫膠蠶絲的納米圖案化修飾分析：將所制得的脫膠蠶絲樣本（纏繞于PTFE 架子上的脫膠絲）置于等離子體處理儀中刻蝕進行納米圖案化修飾。處理功率為150 W，氣氛為空氣，壓強維持在30 Pa。探索的刻蝕時間分別為10、30、50 min，并將其制備獲得的納米圖案化修飾脫膠蠶絲依次命名為10 min-etched silk（10E silk）、30 min-etched silk（30E silk）、50 min-etched silk （50E silk）。

2. 各類脫膠蠶絲的微觀形貌表征分析：采用掃描電鏡觀察各類脫膠蠶絲表面的微觀形貌。測試之前，將未刻蝕處理和刻蝕10、30、50 min 的脫膠絲用導電膠粘貼于測試所用樣品臺上，并在脫膠絲表面噴鍍鉑金，噴鍍電流為10 mA，時間為50 s。SEM測試電壓為5 kV。

3. 納米圖案化脫膠蠶絲的圖案特征分析：基于典型的SEM 圖片，進一步采用Image J 軟件進行圖案化脫膠蠶絲表面的納米圖案特征分析。鑒于纖維表面有一定弧度，為盡可能降低相關誤差范圍，統(tǒng)計時僅選取纖維靠中間的區(qū)域（纖維直徑約為10 μm，選取范圍為纖維軸心線上 ± 2 μm 區(qū)域）。使用Photoshop 軟件及Image J 軟件，調整適宜的閾值以有效區(qū)分納米圖案區(qū)域與其他基底區(qū)域，進一步統(tǒng)計納米圖案的面積占比情況，即納米圖案的面積與整個基底面積的比例。

4. 等離子體刻蝕前后單根脫膠蠶絲的力學性能表征：采用帶有高靈敏度傳感器（250 g 載荷傳感器）的動態(tài)力學疲勞試驗機測試未刻蝕處理和刻蝕10、30、50 min 的各類單根脫膠絲的斷裂強度和斷裂伸長率。測試之前，將各類脫膠蠶絲裁剪為長30 mm 的短絲，各組蠶絲數(shù)量至少為7。測試時夾距設為18 mm，拉伸速率為30 mm/min。其中，各類脫膠蠶絲的截面積通過SEM 表征以及Image J 軟件測量所得。首先將脫膠蠶絲用環(huán)氧樹脂AB 膠包埋，待AB 膠固化后，用液氮將其脆斷，進一步用此斷面樣品進行SEM 表征獲得脫膠蠶絲的截面圖片。最后通過Image J 軟件測量出脫膠蠶絲截面積以用于計算對應纖維的斷裂強度。

5. 骨髓間充質干細胞的復蘇、培養(yǎng)與傳代：細胞培養(yǎng)液按α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素體積比為90∶10∶1 的比例配置。將含BMSCs 的凍存管置于37 ℃、75 vol%的乙醇溶液中，搖晃快速解凍。之后轉移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞孵育培養(yǎng)24 h左右更換1次新的培養(yǎng)液以去除凍存液中的DMSO。之后每3 天更換一次培養(yǎng)液。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80% ～ 90%時，用胰蛋白酶將細胞消化。再經(jīng)離心和重懸后重新制得細胞懸液，最后傳代培養(yǎng)于3個培養(yǎng)瓶中。后續(xù)用于材料接種的干細胞均為P3 ～ P5代干細胞。

6. 干細胞在不同脫膠蠶絲樣本上的接種與培養(yǎng)：將未刻蝕處理和刻蝕10、30、50 min 的脫膠蠶絲樣本（纏繞于PTFE 架子上的脫膠絲）置于超低黏附6 孔板中，加入75 vol%乙醇沒過樣本，浸泡2 h 滅菌。移去乙醇，加入PBS 緩沖液浸泡洗滌樣本3次，每次10 min，除去殘留乙醇。最后加入細胞懸液接種于脫膠蠶絲樣本上，接種密度為105/孔，所加細胞培養(yǎng)液為4 ml。隨后每3 天更換1 次新鮮培養(yǎng)液進行材料上的細胞培養(yǎng)。

7. 干細胞在不同脫膠蠶絲樣本上的黏附狀態(tài)評估：由于脫膠絲的自發(fā)熒光特征導致較難通過熒光染色清晰觀察其表面的細胞黏附狀態(tài)。選用SEM 觀察各脫膠蠶絲上的細胞黏附情況，測試電壓為5 kV。供測試用的細胞樣品制備流程為：待細胞接種培養(yǎng)1 d 和4 d 后，棄去細胞培養(yǎng)液，加入2.5%多聚甲醛于4 ℃下固定2 h。棄去固定液，用PBS 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。隨后依次加入體積分數(shù)為30、50、70、75、80、90、100 vol%的乙醇進行梯度脫水；每種濃度的乙醇處理10 min。再加入叔丁醇沒過樣品，置于-80 ℃冰箱冷凍過夜。最后取出樣品進行冷凍干燥。干燥好后將樣品粘貼于樣品臺上，進行鉑金噴鍍處理（電流為10 mA，時間為50 s）。

8. 干細胞在不同脫膠蠶絲樣本上的增殖情況評估：細胞增殖檢測采用CCK-8 試劑盒。參照說明書將α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑按8∶1∶1的體積比配置成CCK-8 工作液。分別檢測細胞在不同脫膠蠶絲樣本上培養(yǎng)1 d 和4 d 后的細胞活力情況，進一步依據(jù)吸光度變化率對比反映相關細胞增殖情況。具體操作步驟為：把附著細胞的脫膠蠶絲樣本轉移至新的培養(yǎng)板中，每孔加入4 ml CCK-8工作液，置于37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育完后每孔吸取200 μL工作液加入96孔培養(yǎng)板內，在波長為450 nm處用酶標儀檢測吸光度。

9. 統(tǒng)計學處理：為提高實驗的準確性和可信度，各項測試的樣品數(shù)量不少于3 個，實驗結果用±s表示。數(shù)據(jù)差異采用Origin 軟件中的One-way ANOVA 進行統(tǒng)計學分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 不同脫膠蠶絲表面的結構特征比較：未刻蝕處理的脫膠蠶絲（NE silk）表面較為光滑，而經(jīng)等離子體刻蝕（10、30、50E silk）的脫膠蠶絲表面均呈現(xiàn)出明顯的納米圖案結構，且納米結構特征在不同處理時間組間也存在較大的差異（圖1）。

圖1 不同時間等離子體刻蝕后脫膠蠶絲的典型表面SEM照片及其閾值化處理后的照片

為了更清楚地觀察對應的納米圖案特征，進一步采用Image J 軟件對不同圖案化脫膠蠶絲表面的典型SEM 照片進行適宜的閾值調整處理（圖1 第2行；其中紅色區(qū)域代表納米圖案區(qū)域）。10E silk 上的納米圖案呈現(xiàn)出彎曲的蠕蟲狀結構；而30E silk和50E silk 上的納米圖案則呈現(xiàn)出明顯的連續(xù)分支狀結構；分支之間還通過一些更為細小的納米結構所連接。隨著刻蝕時間的延長，連續(xù)分支狀納米圖案的橫向尺寸有進一步增大的趨勢?；趫D案特征，統(tǒng)計對應納米圖案的面積占比顯示，10E silk 的納米圖案面積占比均值約為34%，30E silk 約為30%，50E silk 約為28%。表現(xiàn)出隨著刻蝕時間的延長，圖案面積占比逐漸減小的趨勢。

2. 不同脫膠蠶絲的單絲力學性能比較：NE silk的斷裂強度以及斷裂伸長率分別為（500 ± 46）MPa（16.3% ± 2.9%）。10E silk 的對應參數(shù)分別為（451 ± 52）MPa（14.9% ± 1.9%）。30E silk 的對應參數(shù)分別為（362 ± 68）MPa（10.7% ± 2.2%）。50E silk 的對應參數(shù)分別為（321 ± 76）MPa（6.9% ±2.4%）（圖2）。相比于NE silk，10、30、50E silk 分別保留有原材料90%、72%、64%的斷裂強度，以及92%、65%、42%的斷裂伸長率（表1）。

表1 不同時間等離子體刻蝕后單根脫膠蠶絲的斷裂強度、斷裂伸長率保持率（%， ± s）

表1 不同時間等離子體刻蝕后單根脫膠蠶絲的斷裂強度、斷裂伸長率保持率（%， ± s）

組別NE silk 10E silk 30E silk 50E silk斷裂強度保持率100 ± 9 90 ± 10 72 ± 13 64 ± 15斷裂伸長率保持率100 ± 17 92 ± 11 65 ± 13 42 ± 14

圖2 不同時間等離子體刻蝕后單根脫膠蠶絲的力學性能比較 A應力-應變曲線 B用于計算斷裂強度的脫膠蠶絲截面SEM照片

3. 不同脫膠蠶絲的干細胞黏附和增殖情況比較：第1天時，各脫膠絲表面的大部分細胞均呈現(xiàn)出拉長的黏附形態(tài)。對比顯示，NE silk 上的細胞黏附數(shù)量相對較少，鋪展狀態(tài)也較差。圖案化脫膠蠶絲上的細胞鋪展相對更好，且細胞數(shù)量也有所增多。第4 天時，各脫膠蠶絲上的細胞數(shù)量較第1 天時均有明顯增加，且大部分細胞仍然呈現(xiàn)出沿纖維軸向拉長的黏附形態(tài)。但橫向對比各組仍然可以看到圖案化脫膠蠶絲上的細胞數(shù)量更多，其中以50E silk組為最優(yōu)（圖3）。

圖3 干細胞在不同時間等離子體刻蝕后脫膠蠶絲上培養(yǎng)1 d和4 d后的黏附情況。細胞被標記為粉紅色偽彩

細胞接種第1天后，圖案化脫膠蠶絲的OD值均比NE silk 高；其中以50E silk 為最高。這與細胞初始黏附圖片（圖3首行）得到的細胞黏附規(guī)律趨勢較為一致。當培養(yǎng)至第4天后，每個組別的OD值均有明顯升高；其中NE silk、10E silk、30E silk、50E silk分別為（0.80 ± 0.04）、（2.21 ± 0.02）、（2.35 ± 0.27）、（2.73 ± 0.28）。圖案化脫膠蠶絲與NE silk 相比均存在明顯不同（P< 0.001）；且50E silk組別最高，與其余所有組別對比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過進一步的比較計算獲得其上細胞的吸光 度 變 化 率（OD4d/ OD1d）分 別 為2.2、5.5、5.9 和6.1（表2）；其中50E silk 組別的吸光度變化率顯著高于其余3 組（P< 0.05）。相關定量結果進一步證實圖案化脫膠蠶絲上的細胞增殖速度更快；其中以50E silk為最優(yōu)。

表2 干細胞在不同時間等離子體刻蝕后脫膠蠶絲上培養(yǎng)1、4 d后的CCK-8檢測結果（ ± s）

表2 干細胞在不同時間等離子體刻蝕后脫膠蠶絲上培養(yǎng)1、4 d后的CCK-8檢測結果（ ± s）

組別NE silk 10E silk 30E silk 50E silk OD1 d 0.37 ± 0.01 0.40 ± 0.03 0.40 ± 0.01 0.45 ± 0.03 OD4 d 0.80 ± 0.04 2.21 ± 0.02 2.35 ± 0.27 2.73 ± 0.28

討 論

等離子體刻蝕作為一種干性刻蝕技術已在微納圖案加工中有廣泛應用。除了微電子領域外，近年來在生物材料表面的微納圖案制備和修飾中也有較多應用。Jeon 等［13］采用多孔陽極氧化鋁模板結合O2等離子體刻蝕在聚己內酯（polycaprolactone，PCL）無紡布表面上刻蝕出了較為規(guī)整的納米圖案。該圖案修飾能有效促進MG63成骨細胞的初始黏附和增殖，有望應用于骨組織工程。本研究借助便捷、便于大規(guī)模制備的空氣等離子體刻蝕技術在脫膠蠶絲表面制備出納米圖案，免去模板和特殊氣體的使用，操作便捷。在刻蝕過程中，脫膠絲表面的納米圖案很可能是其自身結構中不穩(wěn)定的軟性區(qū)域（無定形結構含量高的區(qū)域）逐漸被刻蝕去除［14-15］，而更為穩(wěn)定的硬性區(qū)域（β-折疊結構含量更高的區(qū)域）逐漸顯露或進一步融合所致。天然蠶絲中絲素蛋白的結晶結構是在其自然狀態(tài)的溫和紡絲過程中形成的，其結晶結構部分可能相較連續(xù)，因而10E silk 呈現(xiàn)出彎曲的蠕蟲狀納米圖案結構。隨著刻蝕時間的延長。軟性區(qū)域將被完全刻蝕去除；硬性區(qū)域則可能會逐漸發(fā)生融合，因而逐漸轉變?yōu)檫B續(xù)分支狀結構的納米圖案，且圖案間相互有所連通?？涛g50 min 時，硬性區(qū)域進一步融合導致納米圖案的尺寸有所增大。

本研究中，脫膠蠶絲經(jīng)過空氣等離子體刻蝕后力學強度有不同程度的下降。其中10E silk 的力學性能下降相對較小，還保留有原始材料90%以上的力學性能。但隨著刻蝕時間的延長，脫膠絲力學強度下降越明顯。相關影響趨勢與等離子刻蝕對其他高分子材料的影響類似［16-18］，主要是由于脫膠蠶絲等高分子材料的表面結構在等離子體刻蝕時受到了不同程度的破壞所致。進一步接種細胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，脫膠蠶絲上細胞均呈現(xiàn)出拉長的黏附形態(tài)；其主要原因可能在于脫膠絲的直徑尺寸約在10 ～ 15 μm；而已有研究報道證實寬度約為10 μm的條紋圖案和直徑約為10 μm的單根PCL纖維均具有顯著的細胞接觸誘導現(xiàn)象，即細胞傾向于沿條紋或纖維的伸展方向進行拉伸生長［19-20］。另外，相比于對照組，圖案化脫膠蠶絲上細胞黏附鋪展相對更好且數(shù)量也更多，這可能與此類較為連續(xù)的納米級圖案有效增加了材料表面的粗糙度，進而提升了細胞的黏附能力有關［21-23］。對比不同處理時間的脫膠絲可以發(fā)現(xiàn)，處理時間較長組別上細胞黏附的數(shù)量更多。其原因可能在于隨著刻蝕時間的延長，其纖維表面連續(xù)納米圖案的橫向尺寸均在逐漸增大。對于納米尺度的蠕蟲狀或連續(xù)分支狀結構，由于細胞焦點黏附，尤其是穩(wěn)定焦點黏附的形成需要一定的臨界尺寸（大約在幾百納米到幾微米級別）［24-25］，圖案橫向尺度的增加預計會更利于穩(wěn)定焦點黏附的形成，進而更利于細胞的黏附和鋪展。體內植入材料的細胞活性亦是成功實現(xiàn)組織修復的關鍵指標，具有更優(yōu)的促細胞黏附和增殖的材料通常更容易募集周圍細胞開展骨組織或其他組織缺損的修復。與對照組相比，脫膠蠶絲的納米圖案化修飾可以顯著促進干細胞的黏附和增殖行為，刻蝕時間為50 min 的組別（50E silk）具有最優(yōu)的促細胞黏附和增殖能力。50E silk 對細胞增殖能力的提升約為未修飾對照組的2.8 倍，明顯高于其他研究中的一些常用圖案化修飾策略［26-27］。相關影響可能是圖案化脫膠蠶絲表面粗糙度的增加以及各類納米圖案固有特征結構綜合作用所導致的。

綜上所述，采用空氣等離子體刻蝕技術可實現(xiàn)脫膠絲表面較為規(guī)整的納米圖案化修飾，且相關納米圖案的特征可通過調節(jié)等離子體刻蝕時間等參數(shù)有效調控。相比于無修飾的脫膠絲材料，納米圖案化修飾后的脫膠絲可以顯著促進干細胞的黏附和增殖，且大體呈現(xiàn)出處理時間越長、效果越優(yōu)的趨勢。進一步考察單根脫膠絲的力學性能變化，預計刻蝕時間為10 min 的脫膠蠶絲（10E silk）在手術縫合線或機體骨組織等取向受力組織修復領域具有更優(yōu)的應用前景；其原因在于此類納米圖案化修飾既顯著提升了干細胞的黏附和增殖能力，又保有原材料90%以上的斷裂強度和斷裂伸長率。

利益競爭聲明所有作者聲明，無已知的可能影響本文所述工作的相互競爭的經(jīng)濟利益或個人關系。