李祎,熊犍,崔春

(華南理工大學 食品科學與工程學院,廣州 510641)

葵花籽經(jīng)過壓榨或直接浸提法榨取油脂后所剩殘渣稱為葵花籽粕,它是繼豆粕、雙低菜籽粕和棉籽粕之后的第四大油粕。目前,我國對葵花籽的精深加工僅限于提取油脂,加工副產(chǎn)物葵花籽粕僅少部分用作動物飼料,其余直接拋棄,未能得到充分和有效的利用[1]。

葵花籽粕中含有2%～4%(取決于含殼量)的綠原酸。綠原酸是一種重要的生物活性膳食多酚,具有抗氧化、抗菌、降血脂、降血壓、降血糖等多種重要的藥理作用,在食品、藥品和化妝品領域有一定應用價值[2-4]。目前工業(yè)生產(chǎn)綠原酸主要以價格昂貴的金銀花(綠原酸含量為4.29%～6.07%)和杜仲(綠原酸含量為2%～5%)為原料[5-6],與之相比,葵花籽粕價格低廉且產(chǎn)量高,以葵花籽粕為原料可降低綠原酸的生產(chǎn)成本。

提取綠原酸的方法主要為溶劑浸提法,提取劑為水或者有機溶劑[7]。溶劑浸提法的工藝簡單,但在浸提過程中,原料中的多糖、蛋白質等雜質也會溶出,導致產(chǎn)物的純度降低,需要進一步純化[8]。綠原酸的純化方法包括有機溶劑萃取法[9-10]、大孔樹脂柱層析法[11-13]、膜分離法等[14-15]。大孔樹脂柱層析法和膜分離法均對提取液預處理要求高、工藝耗時長,且膜和樹脂清洗困難,因此對于大規(guī)模生產(chǎn)而言,有機溶劑萃取法是最合理的方法。

本文選擇乙醇浸提法作為提取葵花籽粕綠原酸的方法,通過單因素實驗和響應面設計實驗優(yōu)化工藝條件。為了提高綠原酸的純度,對粗提綠原酸進行乙酸乙酯萃取,采用高效液相色譜法鑒定最終產(chǎn)物的純度,對比了常規(guī)乙酸乙酯萃取法與逆流乙酸乙酯萃取法的純化效果。本文確定了提取與純化葵花籽粕綠原酸的最佳工藝,提高了葵花籽粕的綜合利用價值,為我國葵花籽粕深加工及綜合利用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花籽粕(含殼)。 綠原酸標準品(≥98%):購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈(均為色譜純):購自RCI Labscan Ltd.;其他試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設備

AL204型萬分之一天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司;pH-3E型 pH計 上海雷磁儀器廠;UV-754型紫外分光光度計 淄博森源電氣有限公司;Spectra Max 190型全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;SCIENTZ-18N型冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠;HYP-308型消化爐、KDN-103F型自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;GL-21M型高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;LC100型高效液相色譜儀 上海伍豐科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

將葵花籽粕原料經(jīng)高速粉碎機粉碎,過40目篩,按照料液比1∶3加入正己烷脫脂8 h后在通風櫥內(nèi)過夜風干。

1.3.2 葵花籽粕綠原酸提取與純化工藝流程

葵花籽粕→粉碎→過40目篩→乙醇溶液浸提→離心,保留上清液→濃縮→乙酸乙酯萃取→濃縮、冷凍干燥→葵花籽粕綠原酸。

1.3.3 提取綠原酸工藝優(yōu)化

在控制其他因素相同的條件下,分別考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、浸提時間(1,2,3,4,5,6 h)、浸提溫度(30,40,50,60,70 ℃)、乙醇溶液濃度(0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)和浸提次數(shù)(1,2,3次)各單因素對綠原酸得率的影響。每組做3次平行。

在單因素實驗結果的基礎上,運用Design-Expert 12.0.3.0進行響應面優(yōu)化實驗設計,以浸提溫度、浸提時間和料液比為自變量,以綠原酸得率為響應值,采用三因素三水平響應面分析法設計實驗進行組合優(yōu)化。響應面設計因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.3.4 純化綠原酸工藝優(yōu)化

對比常規(guī)乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯逆流萃取這兩種工藝的純化效果。為了節(jié)省乙酸乙酯的用量,先將提取液濃縮至原體積的1/5,再進行萃取。具體操作步驟如下。

常規(guī)乙酸乙酯萃取:將濃縮后的提取液pH調至4.0,加入等體積的乙酸乙酯,室溫下使用磁力攪拌器攪拌一定時間,然后將混合液置于分液漏斗中,靜置分層后分離上下層,上層(乙酸乙酯相)保存,下層(水相)再次萃取,共進行3次,每次的萃取時間分別為0.5,1,1.5 h。3次萃取后保留乙酸乙酯相,用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯相中大部分乙酸乙酯,加水稀釋,冷凍干燥后得到綠原酸粗品。

乙酸乙酯逆流萃取:基于上述乙酸乙酯萃取方法的乙酸乙酯用量較大,為了在工業(yè)生產(chǎn)中節(jié)約成本,探索了逆流萃取工藝進行純化,將乙酸乙酯循環(huán)使用,其余操作與常規(guī)乙酸乙酯萃取一致,流程見圖1。用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯相中大部分乙酸乙酯,加水稀釋,冷凍干燥后得到綠原酸粗品。

圖1 葵花籽粕綠原酸純化工藝流程

1.3.5 檢測與分析方法

綠原酸含量采用高效液相色譜法測定[16]。蛋白質含量采用凱氏定氮法測定[17]?？偺呛坎捎帽椒?硫酸法測定[18]。

根據(jù)公式(1)、公式(2)和公式(3)計算綠原酸得率、提取率和萃取率。

(1)

(2)

(3)

式中:c為測得的稀釋液中綠原酸濃度,μg/mL;v為浸提液體積,mL;m為原料質量,g;AU為乙酸乙酯相溶液中綠原酸的含量,g;AL為原浸提液中綠原酸的含量,g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin 2021 及SPSS 22 等進行數(shù)據(jù)的整理、分析和作圖,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 檢驗,P<0.05 表示有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 提取綠原酸單因素實驗

料液比、浸提時間、浸提溫度和乙醇濃度是對綠原酸提取率影響最大的4個因素,這4個因素若控制得當可提高綠原酸的提取率,并在一定程度上減少成本、縮短工藝時長、節(jié)約能耗。分別考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、浸提時間(1,2,3,4,5,6 h)、浸提溫度(30,40,50,60,70 ℃)、乙醇溶液濃度(0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)和浸提次數(shù)(1,2,3次)各單因素對綠原酸得率的影響,結果見圖2。

圖2 不同因素對綠原酸得率及提取率的影響

由圖2中A可知,隨著料液比的增大,綠原酸得率先增大后趨于平穩(wěn)。當料液比達到1∶15時綠原酸得率達到平穩(wěn)期,為(2.28±0.05)%,提取率為(77.32±1.80)%。料液比增大雖有利于綠原酸溶出,但料液比過高會大大增加濃縮過程中的能耗。綜上考量,選擇料液比為1∶15進行下一步優(yōu)化。

由圖2中B可知,隨著浸提時間的增加,綠原酸得率先快速增長后趨于平穩(wěn)。當提取時間為3 h時綠原酸得率達到平穩(wěn)期,為(2.23±0.02)%,提取率為(75.7±0.79)%。因此,選擇浸提時間為3 h進行下一步優(yōu)化。

由圖2中C可知,隨著浸提溫度的升高,綠原酸得率先增大后減小。當提取溫度為60 ℃時綠原酸得率最大,為(2.29±0.08)%,提取率為(77.79±2.69)%。因此,選擇浸提溫度為60 ℃進行下一步優(yōu)化。

由圖2中D可知,在水中添加乙醇更利于提取綠原酸,當浸提液中乙醇濃度為0%～50%時,隨著乙醇濃度的增加,綠原酸得率增大。乙醇濃度為50%時,綠原酸得率最大,為(2.30±0.05)%,提取率為(77.90±1.78)%。但當乙醇濃度大于50%時,繼續(xù)增加乙醇濃度無法提高綠原酸得率。因此,選擇50%乙醇濃度進行下一步優(yōu)化。

由圖2中E可知,采用50%乙醇溶液浸提1次時提取率為(77.90±1.78)%,在浸提2次時達到最大提取率(85.90±0.83)%,漲幅并不大。多次浸提不僅操作復雜、耗時較長,而且因反復添加浸提液、升溫、離心等過程增加了能耗和成本。從工時、能耗和成本3個方面綜合考慮,決定浸提1次。

2.2 提取綠原酸響應面實驗設計及結果

2.2.1 設計方案及結果

采用中心組合Box-Behnken設計方案,共有17組實驗,相應的響應面設計方案及實驗結果見表2。

表2 響應面設計方案及實驗結果

2.2.2 模型建立與數(shù)據(jù)分析

運用 Design-Expert 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到綠原酸得率(Y)對自變量浸提溫度(A)、浸提時間(B)和料液比(C)的二次多項回歸模型方程:Y=2.09+0.043 8A+0.048 8B+0.200 0C+0.047 5AB-0.120 0BC-0.210 3A2-0.060 3B2-0.157 7C2。

回歸方程方差分析結果見表3?；貧w模型的參數(shù)F=52.41,P<0.000 1,表明響應面的模型與實驗數(shù)據(jù)非常吻合。R2=0.985 4,表明模型具有可靠性,RAdj2=0.966 6,表明模型可以較好地反映響應值的變化。失擬項的F=5.22,P=0.072 1>0.05,不顯著,表明模型與預測值之間的擬合度較好。變異系數(shù)較低(C.V.<5%),表明實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性較高,此模型可以分析和預測葵花籽粕綠原酸的提取結果。

表3 回歸模型方差分析表

模型一次項C的影響極顯著(P<0.01),A和B的影響顯著(P<0.05);二次項A2、C2的影響極顯著(P<0.01),B2的影響顯著(P<0.05);交互項BC的影響極顯著(P<0.01),AB的影響顯著(P<0.05),AC的影響不顯著(P>0.05)。對比A、B、C的F值可知,3個因素對綠原酸得率的影響主次順序為C(料液比)>B(浸提時間)>A(浸提溫度)。

浸提溫度和浸提時間、浸提溫度和料液比、浸提時間和料液比這3組因素之間存在交互作用,對其進行響應面分析,探究各因素之間的交互作用對綠原酸得率的影響,所得響應面圖和等高線圖見圖3。

圖3 各因素交互作用對綠原酸得率影響的響應面和等高線圖

2.2.3 驗證實驗

采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件:浸提溫度60.678 ℃、浸提時間2.678 h、料液比1∶18.775 (g/mL)。在此條件下,模型預測葵花籽粕綠原酸得率為2.157%。為便于控制葵花籽粕綠原酸的提取條件,將提取參數(shù)設置為浸提溫度60 ℃、浸提時間2.5 h、料液比1∶18 (g/mL)。在此條件下開展綠原酸提取的3次平行驗證實驗,結果顯示葵花籽粕綠原酸得率平均值為(2.12±0.02)%,實際值與模型預測值比較相近,說明模型對葵花籽粕綠原酸提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行,具有一定實用價值。

2.3 純化綠原酸結果分析

2.3.1 乙酸乙酯萃取率分析

有研究選取了3種極性不同的代表溶劑,石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取綠咖啡豆綠原酸[10],研究結果表明石油醚的極性太小,幾乎無法萃取到綠原酸;正丁醇的極性較大,可以萃取得到較多綠原酸,但同時也萃取到比綠原酸極性大的雜質,無法達到純化的目的;乙酸乙酯能夠萃取綠原酸,但每次萃取的量不高,若想要富集綠原酸需要多次萃取。該研究表明,水相為酸性時,乙酸乙酯對綠原酸的萃取率有所增加,可能是因為酸性條件下綠原酸減少電離,從而在有機相中溶解度提高。本實驗選用乙酸乙酯作為萃取劑,并在萃取前將水相的pH調整至4.0,以提高綠原酸的萃取率。實驗考察了萃取次數(shù)對綠原酸萃取率的影響,結果見圖4。

圖4 不同萃取次數(shù)下的萃取率

由圖4可知,隨著萃取次數(shù)的增加,單次萃取率逐漸下降,當萃取次數(shù)為3次時,單次萃取率比較小,為11.22%,累計萃取率為69.96%。郭佩佩[9]在提取杜仲葉綠原酸的研究中也發(fā)現(xiàn)相同規(guī)律,并且繼續(xù)增加萃取次數(shù)也無法使累計萃取率顯著提高,且會增加成本和工作量。因此,本實驗最終選定萃取次數(shù)為3次。

2.3.2 純化前后產(chǎn)物主要成分

采用最佳提取工藝條件對葵花籽粕進行乙醇浸提,得到未純化綠原酸,再分別使用兩種萃取方法純化3次,得到常規(guī)乙酸乙酯萃取的綠原酸和乙酸乙酯逆流萃取的綠原酸。對比原料與以上3種產(chǎn)物的主要成分,評估綠原酸的提取和純化效果,結果見表4。

表4 純化前后產(chǎn)物主要成分比較

由表4可知,與原料相比,經(jīng)乙醇浸提得到的未純化綠原酸的含量明顯提高,蛋白質含量明顯減少,總糖含量基本不變;經(jīng)常規(guī)乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯逆流萃取后,綠原酸含量由18.73%提高至70.26%,蛋白質和總糖含量均減少。可見,兩種乙酸乙酯萃取方法均能顯著提高綠原酸的純度,且二者的純化效果基本一致。由于乙酸乙酯逆流萃取的乙酸乙酯用量僅為常規(guī)乙酸乙酯萃取的1/3,因此,選定乙酸乙酯逆流萃取為最佳純化工藝。

2.3.3 產(chǎn)物鑒定

通過上述實驗可確定葵花籽粕綠原酸的最佳提取與純化工藝,方法的重復性良好,將所得3種產(chǎn)物通過高效液相色譜儀進行鑒定,并與綠原酸標品(≥98%)對比,色譜條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相乙腈-0.1% TFA水溶液,流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長327 nm,進樣量10 μL。梯度洗脫條件見表5,色譜圖見圖5。

表5 梯度洗脫條件

由圖5可知,3種產(chǎn)物的主要成分均為綠原酸;與未純化的綠原酸的譜圖相比,常規(guī)乙酸乙酯萃取的綠原酸和乙酸乙酯逆流萃取的綠原酸的譜圖中綠原酸峰的峰高增加、峰面積增大、雜質峰數(shù)量減少,說明兩種萃取方法可以達到較好的純化效果。

3 結論

本實驗通過單因素實驗和響應面分析法對葵花籽粕綠原酸的提取工藝進行了優(yōu)化,確定了提取綠原酸的最佳工藝條件為料液比1∶18 (g/mL)、浸提溫度60 ℃、浸提時間2.5 h,在此條件下綠原酸得率為(2.12±0.02)%。用乙酸乙酯逆流萃取技術對粗提綠原酸進行純化,經(jīng)高效液相色譜儀鑒定,所得綠原酸雜質較少,純度由18.73%提高至70.26%。