黃小玲,陳鐸,崔春*

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院,廣州 510640;2.梅州市飛龍果業(yè)有限公司,廣東 梅州 514000)

農產品加工過程中會產生大量的副產物,這些副產物除部分被用作動物飼料和土地肥料外,大多數被直接丟棄,造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[1]。事實上,有些農副產物富含膳食纖維、黃酮、多酚、精油等生物活性物質[2],將這些活性成分進一步開發(fā)應用于食品添加劑或膳食補充劑可以達到副產物的高值化利用,從而實現資源效益最大化[3]。目前大多數研究主要集中于對酚類化合物的提取和利用上,而較少考慮纖維等不溶性成分[4]。膳食纖維是一種天然的碳水化合物聚合物,主要存在于植物細胞壁中,易與酚類物質結合,形成抗氧化膳食纖維[5]。此外,膳食纖維也被稱為益生元,可以選擇性地刺激結腸中益生菌的活性并促進其增長[6]。因此,富含膳食纖維和酚類化合物的原料作為功能性和益生元成分在創(chuàng)新食品中具有廣泛的應用前景。

益生菌被定義為活的微生物,適量攝入后對宿主機體有益[7]。研究證實,乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬和布拉迪酵母菌對宿主健康有益,其對人體的益生特性也被充分研究,工業(yè)上廣泛用作開發(fā)新型益生元的供試益生菌[8-10]。

本文以水果、谷物和食用菌等加工過程中產生的常見農副產物(橙皮、橙瓤、陳皮渣、菠蘿渣、蘋果渣、米糠、香菇渣、靈芝渣)為研究對象,對其基本成分和抗氧化活性進行測定和評價,并選取兩種益生菌進行體外模擬發(fā)酵,通過觀察益生菌生長過程中活菌數、pH和短鏈脂肪酸3個指標來探討不同來源農副產物作為新型益生元的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

橙皮、橙瓤、菠蘿渣、蘋果渣:橙子、菠蘿和蘋果榨汁后的副產物,梅州市飛龍果業(yè)有限公司;陳皮渣:廣州綠萃生物科技有限公司;香菇渣、靈芝渣:香菇和靈芝經熱水提取后的副產物,無限極(中國)有限公司;米糠:中山市聚豐園糧油食品有限公司;Probio-Tec?AB-SastBl-12(嗜酸乳桿菌-雙歧桿菌復合菌,簡稱AB菌):丹麥科漢森股份有限公司;布拉迪酵母菌:善邑食品(上海)有限公司;丙酮、碳酸鈉、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純):廣東廣試試劑科技有限公司;沒食子酸:北京百靈威科技有限公司;蘆丁:上海源葉生物科技有限公司;福林酚、氫氧化鈉、乙醇、2,2′-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司。

MRS活化培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母膏4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、七水磷酸氫二鉀2.0 g、三水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、七水硫酸鎂0.2 g、四水硫酸錳0.05 g,用無菌水定容至1 L,調pH至6.2±0.2。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基):蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g,用無菌水定容至1 L,調pH至6.0±0.2。

1.2 主要儀器與設備

紫外可見分光光度計、電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司;LC-100液相色譜儀 上海伍豐科學儀器有限公司;pH計量儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;XW-80A漩渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司;SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基本成分的檢測

參照GB 5009.3-2016測定樣品的水分含量;參照GB 5009.6-2016中的索氏抽提法測定樣品的脂肪含量;參照GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定樣品的蛋白質含量;參照GB 5009.88-2014測定樣品的可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維含量;參照GB 5009.4-2016測定樣品的灰分含量。

1.3.2 多酚含量的測定

采用福林-酚法[11],以沒食子酸為標準品,以沒食子酸濃度(mg/mL)為橫坐標、吸光度A765 nm為縱坐標繪制標準曲線:Y=62.4X+0.047 3(R2=0.997 9)。

稱取0.50 g樣品,按料液比1∶10 (質量與體積比)加入80%丙酮,常溫下200 W超聲提取20 min后進行離心(5 000 r/min,15 min),收集上清液,濾渣按前面步驟重復2次[12],合并上清液。將上清液于50 ℃旋轉蒸發(fā)。將濃縮物用蒸餾水定容至50 mL棕色容量瓶中,得到多酚提取液,備用。將1 mL提取液與2 mL福林-酚試劑混合后靜置3 min,再加入10% Na2CO3溶液2 mL,定容至25 mL,混勻后置于暗處反應90 min,在765 nm波長處測定吸光度,根據標準曲線計算總酚含量,以每克干基(dry weight,DW)樣品中含有相當于沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)的毫克數(mg GAE/g DW)表示。

1.3.3 黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉法[13],以蘆丁為標準品,以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標、吸光度A510 nm為縱坐標繪制標準曲線:Y=1.235 9X+0.035 4(R2=0.999 7)。

稱取0.20 g樣品,按料液比1∶10(質量與體積比)加入70%甲醇,70 ℃水浴浸提20 min,然后進行離心(5 000 r/min,15 min),收集上清液[14]。濾渣按前面步驟重復2次,合并上清液,用70%甲醇定容至10 mL,得到黃酮提取液,備用。移取1 mL提取液于25 mL容量瓶中,另取5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL和10%硝酸鋁溶液1.0 mL,混勻,靜置6 min;加4%氫氧化鈉溶液4 mL,用70%甲醇定容至25 mL,搖勻,靜置15 min。顯色穩(wěn)定后,在510 nm處以70%甲醇管為空白,測定其吸光度,根據標準曲線計算總黃酮含量,以每克干基樣品中含有相當于蘆丁當量(rutin equivalent,RE)的毫克數(mg RE/g DW)表示。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 樣品乙醇提取液的制備

參考唐明明等[15]的方法,將樣品與70%乙醇按照0.25,0.5,1,2,4,8 mg/mL的濃度稱取,常溫下200 W超聲提取30 min后離心(5 000 r/min,15 min),收集上清液,待用。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率的測定

參考張智等[16]的方法,取1 mL不同濃度的樣品乙醇提取液于試管中,加入3 mL 0.1 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液,混勻,室溫下避光反應30 min。反應完全后,于517 nm波長處測定溶液的吸光度?？瞻捉M為1 mL無水乙醇和3 mL 0.1 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液。對照組為1 mL不同濃度的樣品乙醇提取液和3 mL無水乙醇。半抑制濃度(IC50)是指當清除率達到50%時的樣品濃度,用來衡量自由基清除率。

式中:A0為空白組的吸光度值;A1為樣品組的吸光度值;A2為對照組的吸光度值。

1.3.4.3 ABTS自由基清除率的測定

參考唐明明等[15]的方法,取一定量的ABTS,用磷酸鹽緩沖液(PBS,0.2 mol/L,pH 7.2)溶解配制成7 mmol/L溶液,再加入等體積的2.45 mmol/L過硫酸鉀,混勻,室溫下避光反應16 h后得到ABTS儲備液,使用時將其稀釋至吸光度值為0.7±0.02。取0.15 mL樣品乙醇提取液于試管中,再加入ABTS稀釋液2.85 mL,室溫下避光反應10 min后,于734 nm波長處測其吸光值。對照組為0.15 mL乙醇溶液和2.85 mL ABTS稀釋液。

式中:A0為樣品組的吸光度值;A1為對照組的吸光度值。

1.3.5 益生菌模擬體外發(fā)酵

1.3.5.1 菌種的活化

菌種活化參考劉露等[17]的方法。

AB菌活化:在無菌操作條件下,將菌種凍干粉接種于已滅菌的MRS活化培養(yǎng)基中,混勻,37 ℃培養(yǎng)24 h,以10%接種量繼續(xù)培養(yǎng)傳代。傳代3次后,取第3代菌液,用生理鹽水稀釋至菌落數量為107CFU/mL,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

布拉迪酵母菌活化:用已滅菌的YPD培養(yǎng)基來活化布拉迪酵母菌,其他操作同上。

1.3.5.2 不同樣品發(fā)酵

參考陳則華等[18]的方法。按質量分數2%分別加入不同樣品至不含葡萄糖的MRS、YPD液體培養(yǎng)基中,振蕩溶解混勻后進行高溫高壓滅菌,冷卻至室溫,待用。在無菌操作條件下,按照5%的接種量分別接種于不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.5.3 益生菌菌落總數的測定

參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定益生菌的菌落總數。

1.3.5.4 發(fā)酵液pH值的測定

使用pH計直接測定發(fā)酵前后發(fā)酵液的pH值。

1.3.5.5 短鏈脂肪酸含量的測定

采用HPLC定量樣品中短鏈脂肪酸含量[19]。取適量樣品發(fā)酵液,在5 000 r/min條件下離心10 min,取1 mL上清液用超純水稀釋5倍,經0.25 μm孔徑濾膜過濾后進行HPLC測定分析。乳酸的標準曲線為Y=1 806.8X-28.389,R2=0.995 9;乙酸的標準曲線為Y=583.54X-3.624 6,R2=0.998 7;丙酸的標準曲線為Y=1 427.4X-3.993 3,R2=0.997 8;丁酸的標準曲線為Y=1 385.4X-9.534 6,R2=0.997 4;其中Y為峰面積,X為短鏈脂肪酸的濃度。色譜條件:色譜柱為MARS MOA(300 mm×7.8 mm,10 μm),進樣量為10 μL,流動相為2.5 mmol/L H2SO4,等度洗脫,流速為0.6 mL/min,柱溫為35 ℃,檢測波長為210 nm。

2 結果與分析

2.1 基本營養(yǎng)成分分析

由表1可知,8種農副產物的基本成分含量存在明顯差異,但每種副產物的主要成分都是膳食纖維。副產物的膳食纖維以不溶性為主,其中蘋果渣中不溶性膳食纖維含量為14.22 g/100 g,而靈芝渣中其含量高達77.66 g/100 g。副產物中可溶性膳食纖維含量遠低于不溶性膳食纖維含量,大部分小于10 g/100 g,其中陳皮渣中含量最高,達到13.15 g/100 g。不溶性膳食纖維主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,有助于腸胃蠕動;可溶性膳食纖維主要為果膠、粘膠等,是結腸中微生物發(fā)酵的重要碳源[20-21]。除膳食纖維外,副產物中還有少量的蛋白質和脂肪殘留?？紤]到副產物中膳食纖維含量高,可以用作開發(fā)含纖維創(chuàng)新食品的原料,如飲料、乳制品或烘焙產品等。

表1 不同副產物的基本成分

2.2 多酚和黃酮含量

對不同副產物的多酚和黃酮含量進行了測定,結果見圖1。

圖1 不同副產物的多酚和黃酮含量

由圖1中A可知,不同農副產物的多酚含量存在一定的差異,其中橙皮的多酚含量最高,高達11.19 mg GAE/g DW,陳皮渣和橙瓤的多酚含量次之,分別為10.83,8.79 mg GAE/g DW,靈芝渣的多酚含量最低,僅為0.71 mg GAE/g DW。多酚是一種重要的生物活性物質,廣泛存在于植物源食品中,具有良好的抗氧化、抗腫瘤、緩解抑郁、降低膽固醇水平和預防心腦血管疾病等生理功效[22]。有研究表明,多酚化合物是潛在的益生元候選者,因為它們是不可消化的可發(fā)酵營養(yǎng)素,有助于促進有益于腸道健康的細菌(益生菌)的生長并增強其活性[23]。由此推測,橙皮和陳皮渣的多酚含量較高,有可能作為新型的益生元。

由圖1中B可知,不同副產物的黃酮含量與多酚含量的分布類似,其中陳皮渣的黃酮含量最高,為15.90 mg RE/g DW,橙皮和橙瓤的黃酮含量次之,分別為12.57,10.30 mg RE/g DW,靈芝渣的黃酮含量最低,僅為2.90 mg RE/g DW。黃酮類化合物大多存在于蔬菜、水果中,對于人體健康具有促進作用。黃酮類化合物通過促進益生菌的生長代謝(產生短鏈脂肪酸)、抑制病原菌的增殖、維持腸道菌群的多樣性來發(fā)揮生物活性作用[24]。因此,推測黃酮含量高的副產物可能會有較強的抗氧化能力和益生活性。

2.3 抗氧化能力

DPPH和ABTS自由基清除率可以用來衡量樣品的抗氧化能力,而且重復性高,常用來評估各種天然化合物的抗氧化能力[25]。測定DPPH和ABTS自由基清除率為50%時不同樣品的濃度(IC50),結果見圖2。

圖2 不同副產物的DPPH和ABTS自由基清除能力

由圖2可知,在8種副產物中,陳皮渣對DPPH和ABTS自由基清除率的IC50值分別為2.19,1.35 mg/mL,半抑制濃度(IC50)較低,表明抗氧化活性較強。而香菇渣的半抑制濃度最高,對DPPH和ABTS自由基清除率的IC50值分別為27.92,17.51 mg/mL,表現出較差的抗氧化能力。Gu等[26]對16種水果和蔬菜的抗氧化性能進行了研究,并通過分離和光譜法測定了單個酚酸和類黃酮的含量,發(fā)現多酚和黃酮的含量與抗氧化活性之間存在高度相關性,其中酚酸對抗氧化活性的貢獻更大,這與本實驗測定的結果一致。總的來說,水果副產物(特別是柑橘類)比谷物和食用菌的抗氧化活性強,推測是抗氧化膳食纖維的良好來源。

2.4 益生菌模擬體外發(fā)酵

2.4.1 益生菌菌落總數

由圖3可知,培養(yǎng)48 h后,相比培養(yǎng)0 h(初始菌落數量均為107CFU/mL),8種不同的副產物均可以提高兩種益生菌的活菌數。此外,研究結果顯示,不同副產物對同種益生菌的增殖效果不同,且同種副產物對不同益生菌的增殖效果也存在差異。以橙瓤作為發(fā)酵底物,AB菌的增殖效果最優(yōu),以蘋果渣和香菇渣作為發(fā)酵底物,AB菌的增殖效果最差,而以橙皮、陳皮渣、菠蘿渣、米糠、靈芝渣作為發(fā)酵底物,對AB菌的增殖效果無明顯差異(P>0.05)(見圖3中A)。相同條件下發(fā)酵48 h,布拉迪酵母菌的數量增長更多(見圖3中B),表明8種副產物對該菌的促增殖能力強于AB菌,其中橙瓤的促增殖效果最好,而菠蘿渣和陳皮渣的促增殖能力明顯弱于其余副產物(P<0.05)。分析差異產生的原因可能是不同益生菌對不同碳源的需求和代謝能力不相同。整體而言,水果副產物(特別是橙皮、橙瓤)和谷物副產物(米糠)對兩種益生菌的促增殖作用較突出,可能是潛在的優(yōu)質益生元。

圖3 體外發(fā)酵48 h后的菌落數量

2.4.2 發(fā)酵液pH值

由圖4可知,兩種益生菌發(fā)酵前后,所有副產物發(fā)酵體系的pH均下降。這是由于副產物作為碳源被益生菌代謝后產生了不同類型的酸性物質(如乙酸等短鏈脂肪酸),從而降低了發(fā)酵液的pH值。對于兩種益生菌而言,以橙皮和橙瓤作為發(fā)酵底物,體系的pH降低幅度最大(P<0.05),表明益生菌對副產物的利用程度高,代謝產生的有機酸含量多。而由香菇渣、米糠和靈芝渣構成的發(fā)酵體系pH變化不明顯,表明益生菌對副產物的消化利用率低。

2.4.3 短鏈脂肪酸含量

不同農副產物經發(fā)酵48 h后短鏈脂肪酸的含量見圖5。

圖5 不同副產物發(fā)酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量

乳酸是益生菌發(fā)酵的重要產物,可以反映益生菌的生長情況[27]。由圖5中A可知,AB菌發(fā)酵48 h后,橙皮和橙瓤發(fā)酵產生的乳酸含量較高,分別為5.31,5.81 mg/mL。布拉迪酵母菌發(fā)酵48 h后,橙皮發(fā)酵產生的乳酸最多,含量達到3.81 mg/mL,其次是橙瓤、米糠和菠蘿渣,分別為2.83,2.75,2.68 mg/mL。短鏈脂肪酸,特別是乙酸、丙酸和丁酸,是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維的重要代謝產物,對人體健康起著重要的作用[28]。乙酸是多數益生菌代謝的主要產物,能夠合成膽固醇,參與人體代謝,為宿主提供能量。由圖5中B可知,AB菌發(fā)酵48 h后,橙皮發(fā)酵產生的乙酸含量較高,為2.19 mg/mL,菠蘿渣、香菇渣和橙瓤次之,乙酸含量分別為1.77,1.65,1.43 mg/mL。布拉迪酵母菌發(fā)酵48 h后,8種副產物發(fā)酵液中的乙酸含量差別不是很大。丙酸可以影響肝臟中膽固醇的代謝,抑制膽固醇的合成,在機體內發(fā)揮積極的作用。由圖5中C可知,AB菌發(fā)酵橙皮產生丙酸的能力最強,發(fā)酵液中丙酸含量為1.74 mg/mL,發(fā)酵靈芝渣產丙酸的能力最弱,發(fā)酵液中丙酸含量僅為0.02 mg/mL。不同副產物均可促進布拉迪酵母菌發(fā)酵產生丙酸,且產丙酸的能力差別不大。丁酸是腸道上皮細胞的主要能量來源,這種短鏈脂肪酸的產量明顯少于其他短鏈脂肪酸,但對于維持機體的健康至關重要。由圖5中D可知,AB菌發(fā)酵橙瓤、米糠和橙皮產生的丁酸較多,分別為0.14,0.13,0.12 mg/mL,而布拉迪酵母菌發(fā)酵橙皮產丁酸的能力強,其余副產物發(fā)酵產丁酸的能力無明顯差異(P>0.05)。

3 結論

本實驗通過對8種農副產物進行比較,結果發(fā)現橙皮、橙瓤和陳皮渣等柑橘類水果副產物的酚類物質含量高、抗氧化活性強,是抗氧化膳食纖維的良好來源。此外,本研究進一步采用體外厭氧發(fā)酵體系評價不同副產物的益生元特性,結果表明橙皮和橙瓤具有顯著的益生作用,表現為促進乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的生成,顯著降低pH值,促進嗜酸乳桿菌-雙歧桿菌復合菌和布拉迪酵母菌等有益菌增殖。