蔡少鵬，鄭麗莎，蔡惠連，封杰妮，朱嫻瓊，高曉露，范巧明，楊慶依，季兵

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣東祈福醫(yī)院，廣東廣州 511400）

糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）發(fā)病率正逐年提高，一項(xiàng)全國(guó)性橫斷面研究結(jié)果表明，45 歲以上人群糖尿病患病率高達(dá)13.21%，其中，90%以上為2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者，且患病率隨年齡增長(zhǎng)而增加[1]。T2DM 與酮癥酸中毒、心血管疾病等急慢性疾病高度相關(guān)，已成為威脅我國(guó)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。然而，臨床上口服的降糖藥如雙胍類、促胰島素分泌劑、α-糖苷酶抑制劑多因胃腸道反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)與代謝障礙、過(guò)敏反應(yīng)、肝功能損害等副作用而存在臨床局限性[2-4]。相對(duì)而言，中醫(yī)藥具有毒副作用小、綜合治療作用、可延緩并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程的加快，對(duì)抗T2DM 中藥復(fù)方的研究也愈加受到關(guān)注。有研究報(bào)道，中醫(yī)藥在抑制β細(xì)胞凋亡、修復(fù)β細(xì)胞功能等方面展現(xiàn)出光明前景[5-7]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎健脾方（淫羊藿、鹿角膠、黃精、沙苑子、制首烏、黃芪、山藥、葛根、丹參、制大黃）具有降低T2DM 患者空腹血糖[7]、糖化血紅蛋白[8-9]、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）[10]等臨床療效，但其具體作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究旨在通過(guò)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)、分子對(duì)接分析潛在的作用機(jī)制，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期進(jìn)一步為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎健脾方治療T2DM 提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 補(bǔ)腎健脾方化合物與相關(guān)靶點(diǎn) 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取補(bǔ)腎健脾方中藥成分及對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行初篩；同時(shí)，通過(guò)BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index）補(bǔ)充中藥成分及靶點(diǎn)，以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行篩選。通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，轉(zhuǎn)化為gene symbol格式。

1.1.2 基因表達(dá)矩陣獲取 通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）獲取基因表達(dá)矩陣：數(shù)據(jù)集GSE18732 基于GPL9486 平臺(tái)，包括118 個(gè)樣本，其中，T2DM 樣本45例，糖耐量異常（IGT）樣本26例，正常樣本47例；數(shù)據(jù)集GSE95849 基于GPL22448 平臺(tái)，包括18 個(gè)樣本，其中，T2DM 樣本6例，正常樣本6例，糖尿病神經(jīng)病變樣本6例。為保證樣本的可對(duì)比性，本研究剔除了糖尿病神經(jīng)病變樣本，僅12 例樣本被納入研究。通過(guò)GEOquery 包獲取基因集信息，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.3 Mfuzz分析 基因通常不是以“開(kāi)-關(guān)”的方式進(jìn)行調(diào)控，而是以漸進(jìn)的方式，這樣可以對(duì)基因功能進(jìn)行更精細(xì)的控制[11]。T2DM 是由正常血糖發(fā)展到IGT后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)變而來(lái)，因此，存在漸進(jìn)性進(jìn)展的改變過(guò)程[12]。與傳統(tǒng)硬聚類不同，Mfuzz 提供了一種軟聚類算法，通過(guò)區(qū)分一個(gè)基因的聚類程度來(lái)反映漸進(jìn)性的變化規(guī)律。本研究以GSE18732 數(shù)據(jù)集樣本臨床信息為依據(jù)，根據(jù)“正常-IGT-T2DM”的轉(zhuǎn)變規(guī)律進(jìn)行Mfuzz分析，獲取與T2DM 轉(zhuǎn)變過(guò)程同步變化的聚類，提取聚類基因用于后續(xù)分析。

1.1.4 差異分析 通過(guò)limma 包提取GSE95849 數(shù)據(jù)集，根據(jù)發(fā)病狀態(tài)進(jìn)行差異分析，以|logFC|≥1且P＜0.05 為條件進(jìn)行篩選，獲取T2DM 與正常樣本存在差異的基因。

1.1.5 藥物作用靶點(diǎn)獲取 分別提取“1.1.1”“1.1.3”“1.1.4”項(xiàng)中補(bǔ)腎健脾方的作用靶點(diǎn)及T2DM 發(fā)展過(guò)程同步變化的差異靶點(diǎn)，獲取交集靶點(diǎn)作為補(bǔ)腎健脾方的作用靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化。

1.1.6 GO富集與KEGG 通路 提取“1.1.5”項(xiàng)中補(bǔ)腎健脾方的作用靶點(diǎn)，通過(guò)clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進(jìn)行富集分析，分別提取P＜0.05 的分子生物功能（MF）、生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和KEGG通路，預(yù)測(cè)補(bǔ)腎健脾方的作用機(jī)制。

1.1.7 核心靶點(diǎn)篩選 提取“1.1.5”項(xiàng)中的作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）獲取靶點(diǎn)的交互作用，隨后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，通過(guò)MCODE 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，計(jì)算靶點(diǎn)的Degree、Betweenness、Closeness等信息，分別提取每個(gè)指標(biāo)排前10 位的靶點(diǎn)，獲取交集靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中具有優(yōu)秀的核心影響作用。

1.1.8 分子對(duì)接 提取度（Degree）值最高的活性成分，與FOS、NOTCH1 進(jìn)行分子對(duì)接。從Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)蛋白FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）的PDB格式（遵循：人源蛋白，分辨率及具有原始配體）。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的mol2 格式。使用PyMOL 2.6.0 對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、去小分子配體，采用AutoDockTools 1.5.7 對(duì)靶點(diǎn)蛋白、活性分子加全氫后進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)PyMOL 對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 4 周齡、體質(zhì)量約20 g 的雄性db/db陽(yáng)性小鼠8只，均購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州銳格生物科技有限公司倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)：20220301-121。

1.2.2 藥物、試劑與儀器 補(bǔ)腎健脾方由淫羊藿12 g、鹿角膠15 g、黃精12 g、沙苑子15 g、制首烏15 g、黃芪30 g、山藥30 g、葛根30 g、丹參30 g、制大黃10 g組成，以上中藥飲片均購(gòu)自廣東祈福醫(yī)院中藥房，加工成凍干粉。胰島素酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；線粒體超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒（廣州博輝生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）；Bax抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3 抗體、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋公司）；FOS 抗體、NOTCH1抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）。酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；RM2016 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；DM500 光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2.3 分組與給藥 將db/db 陽(yáng)性小鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組4只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。治療組給予補(bǔ)腎健脾方凍干粉溶液9.95 g/kg 灌胃，對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)給藥4 周。小鼠灌胃劑量計(jì)算方法：中藥按20%出粉率計(jì)算，補(bǔ)腎健脾方凍干粉人體用量為0.796 g·kg-1·d-1，按小鼠用藥量為人體用藥量25倍計(jì)算小鼠用藥量為19.9 g·kg-1·d-1。

1.2.4 觀察指標(biāo)與方法

1.2.4.1 胰島功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 灌胃4 周后，禁食不禁水6 h，斷頸處死小鼠。腹主動(dòng)脈取血，血糖試紙檢測(cè)空腹血糖水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA 法檢測(cè)空腹胰島素，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=空腹胰島素×空腹血糖/22.5[13]。按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA法檢測(cè)SOD、MDA含量。

1.2.4.2 Western Blot法檢測(cè)小鼠胰腺組織內(nèi)蛋白表達(dá) 取胰腺組織，裂解、離心，收集上清液。取10 μg 蛋白添加到聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上后封閉，分別加入一抗FOS 和NOTCH1 4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST 洗滌3 次后加入二抗孵育，用ImageJ 軟件定量分析蛋白條帶的光密度洗膜，顯影。

1.2.4.3 免疫組織化學(xué)法觀察小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取胰腺組織石蠟切片，脫蠟和水化，抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，封閉。分別與一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3 于37 ℃孵育1～ 2 h，與二抗37 ℃孵育0.5～ 2 h，顯色后拍照。用ImageJ 軟件分析Bax、Bcl-2、Caspase-3 陽(yáng)性面積百分比。Bax、Bcl-2 在細(xì)胞漿表達(dá)，Caspase-3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用R 4.1.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mfuzz 分析隨著正常樣本從IGT 轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)2DM，聚類2、5 呈同步反向變化，聚類7 呈同步正向變化，見(jiàn)圖1。提取上述3個(gè)聚類共3 593個(gè)基因，其表達(dá)量與T2DM 的進(jìn)展有同步變化關(guān)系，提示其可能為T(mén)2DM的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

圖1 Mfuzz分析Figure 1 Mfuzz analysis

2.2 差異分析以|logFC| ≥1、P＜0.05 為條件進(jìn)行差異分析，篩選得到差異基因2 997個(gè)，其中，上調(diào)基因2 834個(gè)、下調(diào)基因163個(gè)，見(jiàn)圖2。通過(guò)繪制韋恩圖，獲取與Mfuzz 分析結(jié)果的交集基因576個(gè)，見(jiàn)圖3。

圖2 火山圖Figure 2 Volcano plot

圖3 韋恩圖Figure 3 Venn diagram

2.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將補(bǔ)腎健脾方活性成分及其靶點(diǎn)與576 個(gè)T2DM 靶點(diǎn)取得交集基因77個(gè)，包括PROS1、FDXR、PYCR2、FOS等，提取交集基因相關(guān)的中藥成分信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。該網(wǎng)絡(luò)包括253 個(gè)節(jié)點(diǎn)和841條邊，根據(jù)Degree值篩選的核心成分主要有黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）。

2.4 GO 富集與KEGG 通路77 個(gè)基因用于GO 富集及KEGG 通路富集分析，提取P＜0.05 的富集結(jié)果。MF 主要富集于氧化還原酶的活性、輔酶結(jié)合等；CC主要富集于細(xì)胞-細(xì)胞接觸區(qū)、線粒體基質(zhì)等；BP 主要富集于缺氧及其響應(yīng)。KEGG 通路主要富集于T2DM、FoxO 通路、cAMP 通路等?？梢园l(fā)現(xiàn)，77個(gè)基因與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。見(jiàn)圖5。

圖5 GO富集與KEGG通路富集Figure 5 GO enrichment versus KEGG pathway enrichment

2.5 核心靶點(diǎn)篩選將77個(gè)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，去除無(wú)連接節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)默認(rèn)，構(gòu)建了一個(gè)63 個(gè)節(jié)點(diǎn)和117 條邊的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)MCODE 模塊分別計(jì)算節(jié)點(diǎn)的Degree、Closeness、Betweenness、MNC、MCC、EPC、EcCentricity和DMNC指標(biāo)，分別提取前10個(gè)節(jié)點(diǎn)獲取共同交集靶點(diǎn)2個(gè)：FOS和NOTCH1。見(jiàn)圖6。通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS 和NOTCH1 在T2DM 樣本中表達(dá)水平顯著高于正常樣本，見(jiàn)圖7。

圖6 花瓣圖Figure 6 Petal diagram

圖7 云雨圖Figure 7 Cloud and rain map

2.6 分子對(duì)接根據(jù)“2.5”項(xiàng)Degree 值排序，篩選了黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）作為主要活性成分，隨后將活性成分和核心靶點(diǎn)FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能見(jiàn)表1。結(jié)合能小于0，表明受體分子與配體分子能自發(fā)結(jié)合；結(jié)合能小于-1.2 kcal·mol-1，表明對(duì)接能力較強(qiáng)，對(duì)接后分子的穩(wěn)定性較高。本研究對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能均小于-1.2 kcal·mol-1，表明活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白均能較穩(wěn)定地結(jié)合。分子對(duì)接的可視化結(jié)果見(jiàn)圖8。

表1 結(jié)合能Table 1 Binding energy

圖8 分子對(duì)接的可視化結(jié)果Figure 8 Visualisation of molecular docking results

2.7 各組小鼠胰島功能比較干預(yù)后，治療組小鼠的空腹血糖、空腹胰島素水平、HOMA-IR 水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

注：①P＜0.05，與對(duì)照組比較

2.8 各組小鼠血清SOD、MDA 比較經(jīng)干預(yù)后，治療組小鼠的SOD水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而MDA水平則低于對(duì)照組（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與對(duì)照組比較

2.9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達(dá)比較干預(yù)后，治療組小鼠胰腺中FOS、NOTCH1 表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達(dá)比較Figure 9 Comparison of FOS and NOTCH1 expressions in pancreatic tissue among each group of mice

2.10 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較干預(yù)后，與對(duì)照組比較，治療組小鼠胰腺Bax、Caspase-3 陽(yáng)性面積百分比降低（P＜0.05），Bcl-2陽(yáng)性面積百分比升高（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表4、圖10～圖12。

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

注：①P＜0.05，與對(duì)照組比較

圖10 Bax 的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 10 Immunohistochemical staining of Bax（×100）

圖11 Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 11 Immunohistochemical staining of Bcl-2（×100）

圖12 Caspase-3的免疫組織化學(xué)染色圖（×100）Figure 12 Immunohistochemical staining of Caspase-3（×100）

3 討論

2 型糖尿?。═2DM）的發(fā)病機(jī)制中，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭是兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在確診糖尿病時(shí)，糖尿病患者的胰島β細(xì)胞功能已下降至正常人的一半，而在糖尿病診斷前10～12年，β細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)顯著減少，并在此后逐年走向衰竭，正常的胰島β細(xì)胞則難以補(bǔ)償胰島素抵抗或不能再發(fā)揮這種補(bǔ)償機(jī)制，明顯加速了T2DM 病程[14-15]。有學(xué)者認(rèn)為，胰島β 細(xì)胞衰竭源于凋亡異常增加[16]，抑制β 細(xì)胞凋亡對(duì)維持β 細(xì)胞數(shù)量及功能具有重要意義[17-18]。

胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)與糖尿病前期相關(guān)，糖尿病前期被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化為糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)，在此期間活性氧（ROS）生成增加，增加的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)T2DM 及血管功能障礙等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致肌肉和脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取受損，并減少β 細(xì)胞的胰島素分泌[20]。Furukawa 等[21]通過(guò)使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制劑減少全身氧化應(yīng)激，改善了肥胖小鼠模型中的葡萄糖代謝。Meigs 等[22]研究的數(shù)據(jù)顯示，胰島素抵抗的患病率與氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-epi-PGF2α濃度呈正相關(guān)，這表明胰島素抵抗與非糖尿病患者和糖尿病風(fēng)險(xiǎn)升高的亞組如肥胖或空腹血糖受損（IFG）中的氧化應(yīng)激相關(guān)。此外，在IFG 受試者中，與空腹血糖正常受試者相比，這種相關(guān)性更高[23-24]?？梢?jiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)β 細(xì)胞功能障礙是誘導(dǎo)胰島素抵抗、促進(jìn)IGT 與T2DM 的關(guān)鍵過(guò)程。然而，目前臨床抗T2DM 的治療藥物發(fā)揮降糖療效的同時(shí)，對(duì)受損的β細(xì)胞進(jìn)一步刺激受損，缺乏促進(jìn)β 細(xì)胞修復(fù)的功能，難以控制日漸衰退的β 細(xì)胞數(shù)量及功能[25-26]。相對(duì)而言，中藥“多靶點(diǎn)”治療優(yōu)勢(shì)在改善糖尿病癥狀的同時(shí)對(duì)β細(xì)胞的保護(hù)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，并逐漸受到臨床的廣泛關(guān)注。

T2DM 歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”的范疇?！捌⒛I虛于內(nèi)，標(biāo)實(shí)于外”是T2DM 的發(fā)病進(jìn)展原因。由于久坐、熬夜等不良生活方式及肥胖發(fā)病率的增長(zhǎng)，目前臨床上以“三多一少”為典型表現(xiàn)的T2DM 患者越來(lái)越少，相反，以疲倦乏力、形體肥胖、脘腹脹滿、腰膝酸軟、舌淡胖有齒痕，苔薄白，脈沉細(xì)無(wú)力等脾腎虧虛證候居多?！鹅`樞·本臟》言：“腎脆則善病消癉易傷?！薄妒颐劁洝?nèi)傷門(mén)》言：“消渴之證，雖分上、中、下而以腎虛致渴，而無(wú)不同也?！蹦I為元陰元陽(yáng)之臟，腎陰虧虛，無(wú)以上濟(jì)，虛火內(nèi)生，精血化生失源，脈道不充，久病累及腎陽(yáng)，不能溫養(yǎng)脾陽(yáng)，加之飲食不節(jié)，脾陽(yáng)受損，日久脾腎虧虛?！端貑?wèn)·經(jīng)脈別論》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺……水津四布，五經(jīng)并行。”氣血依賴于脾胃納運(yùn)相得，因脾胃功能失常，水谷精微無(wú)法轉(zhuǎn)化為氣血輸布，食滯生痰、生熱、生瘀，進(jìn)一步阻滯陽(yáng)氣宣通，而病邪蓄積體內(nèi)表現(xiàn)為血糖、血脂等升高。因此，血糖的升高是病邪“標(biāo)實(shí)”的體現(xiàn)，脾腎耗竭是發(fā)病的根本，降糖等祛邪手段在短期內(nèi)起效顯著，實(shí)則加重了“本虛”，如一線用藥二甲雙胍，其臨床療效受到普遍認(rèn)可的時(shí)候，卻因其藥性寒涼，會(huì)出現(xiàn)腹瀉等脾陽(yáng)受損加重的表現(xiàn)[27-28]；而磺脲類藥物降糖起效快且效果顯著，卻因過(guò)度耗損β 細(xì)胞，動(dòng)搖了根本，導(dǎo)致本虛無(wú)以抗邪出現(xiàn)繼發(fā)性失效。因此，補(bǔ)腎健脾為治療T2DM的要點(diǎn)。

本研究綜合生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出77 個(gè)補(bǔ)腎健脾方的作用靶點(diǎn)，通過(guò)富集分析，77 個(gè)靶點(diǎn)與氧化應(yīng)激過(guò)程關(guān)系密切，并進(jìn)一步篩選出2 個(gè)核心靶點(diǎn)FOS、NOTCH1，通過(guò)分子對(duì)接證明了補(bǔ)腎健脾方的主要活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合穩(wěn)定。最后，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了補(bǔ)腎健脾方可有效降低胰腺FOS、NOTCH1 表達(dá)，并降低脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)MDA，提高抗氧化指標(biāo)SOD 活性，抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)，促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達(dá)，同時(shí)升高HOMA-IR。表明補(bǔ)腎健脾方通過(guò)降低胰腺FOS、NOTCH1 表達(dá)來(lái)緩解氧化應(yīng)激，降低胰島細(xì)胞凋亡，改善胰島素抵抗以延緩T2DM的進(jìn)展。

綜上所述，補(bǔ)腎健脾方可通過(guò)胰腺FOS、NOTCH1等發(fā)揮抗氧化應(yīng)激改善胰島細(xì)胞凋亡，達(dá)到延緩T2DM 進(jìn)展的目的，為其對(duì)T2DM 的防治提供了證據(jù)支持。