張紅陽(yáng)，莫殿軍，陳穎，趙新宇

（1.赤峰學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰 024005）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）為女性常見的生殖內(nèi)分泌與代謝相關(guān)聯(lián)的疾病，影響著我國(guó)5.6%的育齡期女性[1]。PCOS 以高雄激素血癥（HA）、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰島素血癥（HI）為主要特征，遠(yuǎn)期可并發(fā)2 型糖尿?。═2DM）、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、代謝相關(guān)脂肪性肝病等[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，50%～ 70%的PCOS女性伴IR，IR不僅是PCOS的臨床特征，還被認(rèn)為是PCOS 發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[3]，是獨(dú)立于肥胖的在PCOS 發(fā)病機(jī)制中起主要作用的危險(xiǎn)因素[4]，而且在PCOS 生殖和代謝異常的發(fā)生機(jī)理中也起著重要作用。

《女科切要》曰：“肥白婦人，經(jīng)閉而不通者，必是濕痰與脂膜壅塞之故也。”《丹溪心法》記載：“若是肥盛婦人，稟受甚厚，恣于酒食之人，經(jīng)水不調(diào)，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰?！爆F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PCOS 的發(fā)生以臟腑功能失常，痰瘀互結(jié)，阻滯沖任、胞宮、脈道、肌膚而發(fā)為PCOS。由此可見，PCOS 與痰濕密切相關(guān)。PCOS-IR 的中醫(yī)體質(zhì)以痰濕質(zhì)多見[5]，PCOS 痰濕證與IR 明顯相關(guān)[6]，PCOS-IR 病機(jī)關(guān)鍵在于痰濕阻滯。啟宮丸出自《醫(yī)方集解》，書中注釋：“此足太陰厥陰藥也，橘半白術(shù)，燥濕以除其痰，香附神曲，理氣以消其滯，川芎散郁以活其血，則壅者通，塞者啟矣，茯苓甘草，亦以去濕和中，助其生氣也，肥而不孕，多由痰盛，故以二陳為君，而加氣血藥也?！比焦沧嘣餄窕?、健脾理氣活血之功?，F(xiàn)代研究[7-8]顯示，啟宮丸可改善PCOS-IR 狀態(tài)，但其作用機(jī)制不明確。本研究以臨床研究為基礎(chǔ)，通過挖掘GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，探討啟宮丸治療PCOS-IR 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 研究對(duì)象及分組 選取2020年1月至2022年8月就診于赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，明確診斷為PCOS-IR痰濕證的患者，共60 例。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為對(duì)照組與觀察組，每組各30 例。本研究符合赫爾辛基宣言并通過赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：fsyy202147），且所有患者均簽署了知情同意書。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)（1）PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2003年Rotterdam 診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：①稀發(fā)排卵和/或無(wú)排卵；②臨床和/或生化的高雄激素血癥；③超聲檢查結(jié)果提示：一側(cè)或雙側(cè)卵巢內(nèi)直徑在2～9 mm 的卵泡數(shù)≥12個(gè)，和/或一側(cè)或雙側(cè)卵巢體積≥10 cm3。排除其他引起雄激素增高的疾病，如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、釋放雄激素腫瘤和庫(kù)欣氏綜合征等，符合上述3條標(biāo)準(zhǔn)中的任意兩條即可診斷。（2）IR 診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2018年中國(guó)PCOS診治內(nèi)分泌專家共識(shí)[10]：①穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）≥2.69[參照1994年全國(guó)糖尿病防治協(xié)作組調(diào)查庫(kù)中具有完整口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）資料的中國(guó)人]。（3）中醫(yī)痰濕證診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局《多囊卵巢綜合征中醫(yī)診療方案脾虛痰濕證證候診斷》[11]：主癥：婚久不孕，經(jīng)行后期、甚或閉經(jīng)，形體肥胖。次癥：帶下量多，色白無(wú)味；身體倦怠乏力，沉困嗜睡；月經(jīng)量少，或經(jīng)色淡黯；胸腹痞滿。舌脈：舌淡胖或邊有齒痕，苔白或膩；脈滑或沉澀、沉緩。以上主癥具備1項(xiàng)，次癥具備3 項(xiàng)或以上，即可診斷。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡為19～40周歲；②符合PCOS 和IR 診斷標(biāo)準(zhǔn)；③符合中醫(yī)痰濕證診斷標(biāo)準(zhǔn)；④體質(zhì)量指數(shù)（BMI）≥23 kg/m2；⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①具有臨床意義的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病的患者；②精神病患者；③已明確診斷的糖尿病患者；④未控制的高血壓（≥160/100 mmHg）或低血壓（收縮壓＜95 mmHg）患者；⑤肝腎功能異?；颊撸虎藿? 個(gè)月內(nèi)應(yīng)用激素類藥物或近1 個(gè)月內(nèi)服用可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的中藥、西藥或中成藥的患者。

1.1.5 治療方法 對(duì)照組給予鹽酸二甲雙胍片治療，用法：鹽酸二甲雙胍片（北京京豐制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11 021518；規(guī)格：250 mg/片），飯中口服，第一周，每天2次，每次500 mg；第二周起，每天3次，每次500 mg。觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合啟宮丸湯劑治療，用法：?jiǎn)m丸湯劑（由陳皮、半夏、茯苓、白術(shù)、香附、川芎、神曲、甘草8味中藥組成，由赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一提供和煎制，每劑中藥煎取300 mL 并分裝為2袋，150 mL/袋），每日2袋，分2 次于早飯前和晚飯后半小時(shí)溫服。2 組療程均為12周。

1.1.6 觀察指標(biāo)（1）療效性評(píng)價(jià)：觀察2組患者治療前后肥胖指標(biāo)[體質(zhì)量、BMI、腰圍（WC）、腰臀比（WHR）]，性激素指標(biāo)[血清雌二醇（E2）、睪酮（T）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、游離雄激素指數(shù)（FAI）]，糖脂代謝指標(biāo)[空腹葡萄糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、穩(wěn)態(tài)模型胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）]。其中，血清E2、T、SHBG 檢測(cè)試劑及配套儀器購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；FPG檢測(cè)試劑及配套儀器購(gòu)自四川邁克生物科技股份有限公司，F(xiàn)INS 檢測(cè)試劑及配套儀器購(gòu)自濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C 檢測(cè)試劑及配套儀器購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。BMI=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）；WHR=WC（cm）/HC（cm）；FAI=T（nmol·L-1）×100/SHBG（nmol·L-1）；HOMA-IR=FPG（mmol·L-1）×FINS（μU·mL-1）/22.5。（2）安全性評(píng)價(jià)：觀察2 組患者治療過程中腹痛、腹瀉、皮疹等不良反應(yīng)發(fā)生情況，以及肝功能、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)等安全性指標(biāo)的變化情況。以上生化指標(biāo)均由赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢測(cè)。

1.1.7 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)分析；若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析。所有檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 啟宮丸藥物活性成分與靶點(diǎn)篩選 將啟宮丸8味藥物輸入到以下分析平臺(tái)中，符合任何一平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)即可納入：（1）中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18；（2）中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）類藥性≥0.49；（3）中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、PubMed 等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)查閱到的活性成分。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)活性成分進(jìn)行SMILE結(jié)構(gòu)與2D結(jié)構(gòu)查詢，將SMILE 結(jié)構(gòu)輸入FAFDrugs4 平臺(tái)（http://fafdrugs4.mti.univ-paris-diderot.fr）進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)的吸收（A）、分布（D）、代謝（M）和轉(zhuǎn)化（E）信息查詢，以結(jié)果中“Accepted”為活性成分納入指標(biāo)。匯總活性成分，整理去重。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥高通量實(shí)驗(yàn)和參考數(shù)據(jù)庫(kù)（HERB，http://herb.ac.cn/）中查找活性成分的ID。

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將活性成分SMILE結(jié)構(gòu)輸入到STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)（http://stitch.embl.de/），2D結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction 平臺(tái)（http://swisstargetprediction.ch/），通過化學(xué)相似性進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。整理匯總所有靶點(diǎn)，去重。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）將所有靶點(diǎn)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因靶標(biāo)。

1.2.2 PCOS-IR 差異基因靶點(diǎn)篩選 在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中以“polycystic ovary syndrome”或“PCOS”與“insulin resistance”或“IR”為檢索詞進(jìn)行相關(guān)基因芯片檢索。通過閱讀摘要獲得基因芯片，以|log2FC |＞2，校正P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因靶點(diǎn)，繪制火山圖；以前20 個(gè)上調(diào)與下調(diào)基因繪制熱圖。

1.2.3 藥物疾病交集靶點(diǎn)及韋恩（Venn）圖 將啟宮丸靶點(diǎn)與PCOS-IR 靶點(diǎn)采用Venn 圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，初步獲得啟宮丸與PCOS-IR的交集靶點(diǎn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值＞0.40，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)度值（degree）、中介中心性（BC）、緊密中心性（CC），進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)；核心靶點(diǎn)根據(jù)基因表達(dá)量繪制箱狀圖。

1.2.5 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將啟宮丸8 味藥物、對(duì)應(yīng)的活性成分、對(duì)應(yīng)的交集靶點(diǎn)整理于Excel 表格中，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)活性成分進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)degree，篩選前10 位活性成分。

1.2.6 基因本體（GO）生物功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov），以物種限定為“Homo sapiens”，作用靶點(diǎn)為“Gene List”，進(jìn)行GO 生物功能和KEGG 通路富集分析，并在Omicshare 平臺(tái)（http://www.omicshare.com/tools）可視化，繪制條形圖、圈圖與網(wǎng)狀圖。

1.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 將前5 位靶點(diǎn)蛋白名稱輸入PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/pdb/）中查找到相應(yīng)蛋白受體，下載“method”評(píng)分最低的PDB ID，保存為pdb 格式文件；將前5 位活性成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取2D 結(jié)構(gòu)，保存為sdf 格式文件。用SailVina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，提取結(jié)合能，以結(jié)合能＜-5.0 kJ·mol-1作為核心活性成分與核心靶點(diǎn)有效結(jié)合的篩選依據(jù)。OpenBabel 輸出分子對(duì)接結(jié)果。Pymol 軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行去除水和原配體處理，導(dǎo)出結(jié)合分子結(jié)構(gòu)，在PLIP 網(wǎng)站（https://projects.biotee.tu-dresclen.de/plip-web/plip/index）確定結(jié)合位點(diǎn)，保存為Pymol 格式，在Pymol軟件中進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)殘基可視化與標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 啟宮丸治療PCOS-IR的臨床研究結(jié)果

2.1.1 2 組患者治療前后相關(guān)療效性指標(biāo)比較表1 結(jié)果顯示：治療前，2 組患者的體質(zhì)量、BMI、WC、WHR 以及血清E2、T、SHBG、FAI、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，觀察組的體質(zhì)量、BMI、WC、E2、FAI、FINS、HOMA-IR 均較治療前下降，SHBG、HDL-C 均較治療前上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），而對(duì)照組僅體質(zhì)量、FINS、HOMA-IR 較治療前下降（P＜0.05）；組間比較，觀察組的BMI、E2、FAI、FINS、HOMA-IR的下降幅度均明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 2組多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）患者治療前后相關(guān)療效性指標(biāo)比較Table 1 Comparison of efficacy relevant indicators between the two groups of patients with polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）before and after treatment （）

表1 2組多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）患者治療前后相關(guān)療效性指標(biāo)比較Table 1 Comparison of efficacy relevant indicators between the two groups of patients with polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）before and after treatment （）

注：t1，P1為觀察組治療前后比較；t2，P2為對(duì)照組治療前后比較；t3，P3為治療后觀察組與治療組比較。①P＜0.05，②P＜0.01，與治療前比較；③P＜0.05，與對(duì)照組治療后比較

2.1.2 不良反應(yīng)發(fā)生情況 研究過程中，2 組患者均未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

2.2 啟宮丸治療PCOS-IR的作用機(jī)制預(yù)測(cè)

2.2.1 繪制Venn圖 基于《中華人民共和國(guó)藥典》，結(jié)合在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的篩選，最終獲得啟宮丸活性成分193個(gè)，靶點(diǎn)759個(gè)；通過GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，獲得芯片GSE34526，包括PCOS-IR 7例，健康對(duì)照組3例，應(yīng)用GEO2R 進(jìn)行差異基因分析，共獲得差異基因靶點(diǎn)1 149個(gè)，在線繪制Venn圖，獲得啟宮丸與PCOS-IR 的交集靶點(diǎn)76 個(gè)。結(jié)果見圖1。accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

圖1 啟宮丸與多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）交集靶點(diǎn)Venn圖Figure 1 Venn diagram of the intersected targets of Qigong Pills and polycystic ovary syndrome

2.2.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，其中，藍(lán)色三角表示啟宮丸與PCOS-IR 的交集靶點(diǎn)，正三角表示上調(diào)基因靶點(diǎn)，倒三角為下調(diào)基因靶點(diǎn)；紫色方形為活性成分，結(jié)果見圖2。經(jīng)Cytoscape 3.7.2 中拓?fù)浞治?，得出?0 位的活性成分，結(jié)果見表2。

圖2 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Drugs-active components-target network of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表2 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）的前10位活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)Table 2 Network parameters of the top 10 active components of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

2.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇物種為“Homo sapiens”，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，結(jié)果見圖3；將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選前10位的核心靶點(diǎn)，結(jié)果見表3。

圖3 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI network of targets of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表3 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)Table 3 Network parameters of the core targets of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

2.2.4 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)差異基因分析 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘共獲得差異基因1 149個(gè)，其中上調(diào)958個(gè)，下調(diào)191個(gè)，結(jié)合GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)差異基因表達(dá)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)核心靶點(diǎn)分析，將前5位核心基因在火山圖中標(biāo)記，同時(shí)依據(jù)其表達(dá)量繪制箱狀圖，結(jié)果見圖4。分別將上調(diào)與下調(diào)的前20 個(gè)基因以熱圖表現(xiàn)，結(jié)果見圖5。

圖4 差異基因分析火山圖與箱狀圖Figure 4 Volcano plot and box plot for differential gene analysis

圖5 差異基因表達(dá)熱圖Figure 5 Heat map of differential gene expression

2.2.5 GO 生物功能與KEGG 通路富集分析 GO生物功能富集分析主要從生物過程（BP）、分子功能（MF）以及細(xì)胞組成（CC）進(jìn)行基因注釋。GO 功能富集分析共得到1 550個(gè)條目，包括BP 1 226條、CC 139條、MF 185條，以各條目錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）較小的前10 條作GO 富集分析條形圖，其中條形的長(zhǎng)度代表P值，條形長(zhǎng)度越長(zhǎng)，P值越??；圓點(diǎn)的大小代表該條目上的靶點(diǎn)數(shù)，圓點(diǎn)越大，該條目上的靶點(diǎn)數(shù)越多。GO 富集分析條形圖提示：BP富集在炎癥反應(yīng)、防御應(yīng)答、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)等；MF 富集在與信號(hào)受體結(jié)合、與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、與血紅素結(jié)合等；CC 富集在三級(jí)顆粒、細(xì)胞膜上的膜筏、膜微域等。結(jié)果見圖6。

圖6 GO生物功能富集條形圖Figure 6 Bar chart of the results of GO biofunctional enrichment analysis

KEGG 通路富集分析共得到134 個(gè)條目，選取FDR 值較小的前20 條進(jìn)行可視化，對(duì)前10 條進(jìn)行KEGG 網(wǎng)絡(luò)分析，KEGG 通路圈圖提示信號(hào)通路富集在癌癥通路、癌蛋白多糖通路、糖基化終末產(chǎn)物與特異性受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路等。KEGG富集網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)通路與通路之間的關(guān)系，其中節(jié)點(diǎn)越大表示與相鄰?fù)返倪B接越多，節(jié)點(diǎn)顏色越深表示P值越小?；疑?jié)點(diǎn)表示從KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)充的相鄰?fù)罚瑢?shí)線表示通路與通路之間有關(guān)聯(lián)，虛線表示通路與補(bǔ)充通路的有關(guān)聯(lián)。KEGG 富集網(wǎng)絡(luò)圖提示：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3KAkt）信號(hào)通路在KEGG 網(wǎng)絡(luò)中具有重要的連接作用。結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 KEGG通路富集圈圖Figure 7 Circle map of the results of KEGG pathway enrichment analysis

2.2.6 分子對(duì)接 分別取活性成分與核心靶點(diǎn)中的前5 位進(jìn)行分子對(duì)接，PDB ID 分別為PTGS2（3NT1）、ESR1（7ABB）、AR（4OHA）、PPARG（2POB）、HSP90AA1（5LRL），以結(jié)合能＜-7 kJ·mol-1的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化并標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)殘基。結(jié)果見表4、圖9。

圖9 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）的前5位核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接可視化圖Figure 9 Visualized graph of docking of the top 5 core active components and core target molecules of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表4 啟宮丸作用于多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOSIR）的前5位核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能力Table 4 Docking and binding ability of the top 5 core active components and core target molecules of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）（kJ·mol-1）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，啟宮丸聯(lián)合二甲雙胍治療后多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（PCOS-IR）患者的療效性指標(biāo)有明顯的改善，其中體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、腰圍（WC）、雌二醇（E2）、游離雄激素指數(shù)（FAI）、空腹胰島素（FINS）、穩(wěn)態(tài)模型胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）均較治療前下降，性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）均較治療前上升，尤其BMI、E2、FAI、FINS、HOMA-IR水平均顯著低于單獨(dú)應(yīng)用二甲雙胍治療。既往研究[7，12]結(jié)果顯示，啟宮丸可抑制NF-κB 通路的過度活化，糾正Th17/Treg 失衡，降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等炎癥因子水平，減輕炎癥狀態(tài)，從而改善PCOS-IR 病理狀態(tài)。陳宇等[8]通過觀察發(fā)現(xiàn)，啟宮丸可以調(diào)整卵巢局部胰島素受體底物2（IRS-2）蛋白表達(dá)，提高IRS-2 酪氨酸磷酸化程度，改善PCOS-IR 狀態(tài)。上述研究結(jié)果表明，啟宮丸治療PCOS-IR 的整體效果較好。因此，本研究通過GEO 基因芯片、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

通過啟宮丸藥物-活性成分-靶點(diǎn)的拓?fù)浞治觯Y選出啟宮丸治療PCOS-IR的前5位藥效成分為槲皮素、山柰酚、阿魏酸、沒食子酸、金絲桃苷。槲皮素是最常食用的膳食類黃酮之一，亦稱為植物雌激素。研究表明，槲皮素具有抗糖尿病的特性。槲皮素可以直接促進(jìn)AMP 活化蛋白激酶（AMPK）、胰島素受體底物1（IRS-1）和160 kDa Akt 底物（AS160）磷酸化，增強(qiáng)胰島素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活胰島素信號(hào)通路，同時(shí)在胰島素刺激條件下增加糖原合酶激酶3（GSK3β）[13]，而GSK3β 是參與糖原合成的關(guān)鍵酶，也是本研究中發(fā)現(xiàn)治療PCOS-IR 的核心靶點(diǎn)。此外，槲皮素通過調(diào)節(jié)STAT3/SOCS3/IRS1 信號(hào)通路改善肝臟IR[14]。槲皮素還可以間接改善IR，通過降低血清IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平，減少對(duì)IR 的不良影響，以及抑制顆粒細(xì)胞Toll 樣受體（TLR）/NF-κB 信號(hào)通路，改善卵巢組織的炎癥微環(huán)境，改善PCOS 大鼠卵巢局部IR[15-16]。山柰酚是一種膳食黃烷醇，具有強(qiáng)大的抗炎特性，而炎癥被認(rèn)為是IR 的基礎(chǔ)。Luo C等[17]進(jìn)行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚抑制IkB 激酶的磷酸化和NF-κB 途徑激活與改善肝臟炎癥損傷有關(guān)，從而有助于改善IR。山柰酚也可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。Alkhalidy H 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，以每日50 mg/kg山柰酚喂養(yǎng)肥胖小鼠，可以在未改變體質(zhì)量、未增加食物消耗的情況下有效控制血糖，這與肝葡萄糖生成減少和改善全身胰島素敏感性相關(guān)。另外，山柰酚是丙酮酸羧化酶（PC）的直接抑制劑，可以降低HepG2 細(xì)胞以及從肥胖小鼠肝臟分離的原代肝細(xì)胞的PC 活性并抑制糖異生。由此可見，山柰酚可能是一種天然的抗糖尿病化合物，通過抑制葡萄糖生成和改善胰島素敏感性而發(fā)揮治療作用。阿魏酸是一種廣泛存在于植物中的酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等作用。研究[19]顯示，阿魏酸可增加肥胖小鼠骨骼肌和大腦中IRS-1、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）的蛋白表達(dá)，從而改善IR。沒食子酸是一種植物來源的多酚化合物，是植物界中最豐富的酚酸之一，在動(dòng)物模型中顯示具有抗糖尿病功能[20]。沒食子酸可誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），增強(qiáng)胰島素的敏感性，而PPARG 正是啟宮丸治療PCOSIR 的核心靶點(diǎn)。另外，沒食子酸還可以通過減少細(xì)胞凋亡，改善胰島素分泌[21]。金絲桃苷可以通過抑制活性氧（ROS）的過度產(chǎn)生和線粒體中半胱天冬氨酸蛋白酶的激活，從而促進(jìn)胰島素分泌并減少胰腺β 細(xì)胞的凋亡，預(yù)防糖尿病的發(fā)生；同時(shí)，金絲桃苷具有緩解小鼠IR 的作用，可通過改善胰島功能、增加糖酵解和減少糖異生以預(yù)防糖尿病[22-23]。

通過PPI拓?fù)漕A(yù)測(cè)分析，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、熱休克蛋白90AA1（HSP90AA1）為啟宮丸治療PCOS-IR 的主要核心靶點(diǎn)。Ozbayer C 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2 與IR 相關(guān)，PTGS2 是一種重要的促炎介質(zhì)和啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而炎癥能夠負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素分泌，并降低胰島素敏感性[25]。雌激素被認(rèn)為是血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑，與肥胖、IR和糖尿病的病理生理相關(guān)。本研究中，GEO 數(shù)據(jù)挖掘顯示，PCOS-IR 患者的ESR1 下調(diào)，臨床研究顯示，鹽酸二甲雙胍片聯(lián)合啟宮丸治療后PCOS-IR患者的E2水平較治療前下降，并且E2水平明顯低于單獨(dú)應(yīng)用鹽酸二甲雙胍片治療。由此推斷，啟宮丸可能是通過上調(diào)ESR1，從而促進(jìn)E2 與ESR1結(jié)合，故血清中E2 水平下降。另外，ESR 在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，脂肪細(xì)胞中的ESR 激活增加了特異性蛋白1（SP1）的核含量、SP1/ESR 相互作用及SP1 與Slc2a4 基因啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致Slc2a4/GLUT4 表達(dá)增加[26]。脂肪生成機(jī)制研究表明，AR敲除降低了胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）的表達(dá)，而IGFBP 可以調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）的生物利用度[27]。本研究中，啟宮丸聯(lián)合二甲雙胍治療后FAI明顯下降。由此推測(cè)，啟宮丸可能可通過降低雄激素水平而改善IR。PPARG 是調(diào)節(jié)胰島素敏感性的最重要轉(zhuǎn)錄因子之一。許多研究已經(jīng)證明IR 中PPARG 表達(dá)率降低。除此之外，Maladobra-Mazur M 等[28]基于體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)PPARG 在IR 中的表觀遺傳變化，即組蛋白H3 乙酰化和甲基化程度降低，因此PPARG 及其表觀遺傳修飾可能是IR 的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。HSP90AA1 是真核細(xì)胞中表達(dá)豐富的熱休克蛋白，具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定和糾正錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的作用，而炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致IR的重要因素[29]。將啟宮丸中前5位的核心成分與PCOS-IR的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)合能均＜-5 kJ·mol-1，即均具有較好的結(jié)合活性，證實(shí)啟宮丸治療PCOS-IR的靶向作用。

進(jìn)一步進(jìn)行GO 生物功能富集分析，提示啟宮丸主要參與炎癥反應(yīng)過程干預(yù)PCOS-IR。KEGG 結(jié)果表明，啟宮丸治療PCOS-IR 的信號(hào)通路主要涉及癌癥途徑、癌蛋白多糖通路、糖基化終末產(chǎn)物與特異性受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路等。PCOS 子宮內(nèi)膜存在IR，而IR 正是子宮內(nèi)膜增生甚至癌變的風(fēng)險(xiǎn)因素[30]。PCOS 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激后，PI3K-Akt 通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt 過度活化，因此IR 與PI3K-Akt 通路的過度激活可能是子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。AGE-RAGE 信號(hào)通路與IR 密切相關(guān)。AGEs 與RAGE 結(jié)合后，通過炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致IR。IR 發(fā)生后，高水平血糖會(huì)促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的非酶糖基化，從而形成過多的AGEs，因此，AGE-RAGE 信號(hào)通路與IR之間存在惡性循環(huán)[31]。KEGG 網(wǎng)絡(luò)圖將單個(gè)通路進(jìn)行連接，直觀地表現(xiàn)出通路與通路之間的聯(lián)系，展現(xiàn)生物體內(nèi)密不可分的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。分析結(jié)果顯示，PI3K-Akt 與其他通路連接的緊密度最高，在啟宮丸治療PCOS-IR 的復(fù)雜通路網(wǎng)絡(luò)圖中具有重要的連接作用。

IR 是PCOS 生殖、代謝發(fā)生異常的核心部分。通過生物信息數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)，啟宮丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療PCOS-IR，為臨床治療提供了依據(jù)，同時(shí)后續(xù)應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深入的研究與驗(yàn)證。