呂永琴，蘇海佳，秦培勇，陳必強，譚天偉

(北京化工大學生命科學與技術學院 北京市生物加工過程重點實驗室 國家能源生物煉制研發(fā)中心,北京 100029)

化石燃料的過度利用導致人為CO2大量排放。每年釋放的CO2超過350億t，約為自然環(huán)境吸收速率的2倍[1-2]。預計到21世紀末，大量排放的CO2將導致全球地表溫度升高約2 ℃[3]。根據(jù)2015年簽訂的《巴黎協(xié)定》，世界上大多數(shù)國家同意采用不同方式進行能源管理，以減少CO2的排放[4-8]。我國在2020年提出了2030年實現(xiàn)“碳達峰”，2060年實現(xiàn)“碳中和”的“雙碳”戰(zhàn)略目標。同時，CO2也是儲量豐富的可再生碳源，可用于合成含碳燃料、材料和化學品。因此，實現(xiàn)對CO2的高效資源化利用是保障經(jīng)濟高質量發(fā)展、助力實現(xiàn)全球“雙碳”目標的一種有效策略。

CO2的催化轉化存在多種方法，主要包括熱催化加氫[9-10]、光催化轉化[11-12]、電催化轉化[13]和生物催化轉化[14]等(表1)。其中，電催化CO2還原具有反應條件溫和、反應速率快和便于大規(guī)模工業(yè)應用等獨特優(yōu)勢而備受關注，被視為實現(xiàn)碳中和最有前景的策略之一[15-16]。然而，電催化CO2還原的產物多局限于一碳化合物，如CO、CH4、甲酸和甲醇等，并且產物的選擇性較低。生物催化轉化CO2是利用活細胞或酶作為催化劑，從CO2合成復雜有機分子的過程。與化學催化劑相比，生物酶催化劑具有選擇性高、操作條件綠色溫和以及易實現(xiàn)碳-碳偶聯(lián)、碳鏈延長等優(yōu)點，因此有助于將CO2轉化為高附加值長碳鏈產品[17]。根據(jù)目標產物的不同，可以選擇利用單一酶或多酶作為催化劑。相對于單一酶催化劑，多酶催化劑系統(tǒng)對于生產高附加值產品更具優(yōu)勢。但由于CO2的高化學惰性，C=O鍵(750 kJ/mol)的斷裂需要輸入大量的能量，這使得CO2的活化和斷鍵成為一個難題。同時，CO2在液相反應體系中的低溶解度嚴重影響了酶對底物的親和力和催化效率。

表1 用于CO2轉化的催化方法及各自特點

基于此，研究人員提出了電-酶偶聯(lián)催化轉化CO2策略，即在生物電化學體系中，利用電能驅動酶催化C=O斷鍵，進一步實現(xiàn)碳-碳偶聯(lián)和碳鏈的延長，以高能量效率合成高附加值和長碳鏈化合物。電-酶偶聯(lián)催化為轉化CO2生產附加值燃料、化學品和材料提供了一種新方法。因此，對這一新興領域的最新研究進展及挑戰(zhàn)進行系統(tǒng)性綜述是必要的。本文綜述了酶促電催化CO2還原的最新研究進展，詳細介紹了NAD(P)H非依賴型和NAD(P)H依賴型氧化還原酶的電子傳遞機制，并重點闡述了酶與電極間的相互作用、電極的修飾與改性和新型電-酶耦合體系的構建及研究動態(tài)。此外，對電-酶偶聯(lián)用于CO2催化轉化所面臨的主要挑戰(zhàn)和未來發(fā)展前景進行了概述。

1 電子轉移機制

由于各類酶的催化機制不同，電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)可以分為兩類：NAD(P)H依賴型和NAD(P)H非依賴型系統(tǒng)(圖1)。在NAD(P)H依賴型系統(tǒng)中，氧化型輔因子NAD(P)+接收電子再生為NAD(P)H，NAD(P)H作為電子和質子的載體，輔助酶催化CO2還原，并重新轉變?yōu)檠趸瘧B(tài)的NAD(P)+。在NAD(P)H非依賴型的系統(tǒng)中，氧化還原酶可以通過直接電子轉移(direct electron transfer，DET)或間接電子轉移(mediated electron transfer，MET)兩種方式接受來自陰極的電子。

圖1 電-酶偶聯(lián)催化CO2轉化的電子轉移機制Fig.1 Mechanism of electron transfer in electrocatalytic-enzymatic hybrid systems for CO2 reduction

1.1 NAD(P)H依賴型系統(tǒng)

NAD(P)H是還原型輔因子煙酰胺二嘌呤核苷酸及其磷酸化形式的簡稱。在NAD(P)H依賴型的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)中，實現(xiàn)CO2還原通常需要經(jīng)歷多個電子轉移步驟，其中輔酶NAD(P)+向NAD(P)H的轉化是酶促CO2還原反應發(fā)生的先決條件。通過向陰極施加一定的電壓(大于-0.32 VvsNHE[18])，氧化型的NAD(P)+可以從陰極上獲取電子，反應所需的質子則來源于陽極上發(fā)生的氧化反應，通常為析氧反應。NAD(P)H在金屬電極上直接催化再生的過電位較高，容易生成無活性的副產物[19]。為了解決這一問題，通常需要向電解液中添加更容易發(fā)生氧化還原反應的水溶性電子介體，電子介體從陰極上獲取電子變?yōu)檫€原態(tài)，再擴散到NAD(P)+附近，將電子傳遞給NAD(P)+，使之轉化為NAD(P)H，產生氧化態(tài)的電子介體擴散回陰極繼續(xù)運載電子，實現(xiàn)NAD(P)H的循環(huán)再生。使用游離的電子介體的缺點在于更換電解液時難以回收利用，且可能對酶產生一定的毒性[20-21]，將電子介體修飾在陰極上催化NAD(P)H再生是可行的解決方法之一。

NAD(P)H再生反應的電子轉移過程復雜、副反應多，會對電-酶偶聯(lián)還原CO2系統(tǒng)的長期運行效率造成不利影響。在電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)中使用人工開發(fā)的輔因子類似物能使整體反應的可控性更好，是引入NAD(P)H再生反應的替代策略。常見的輔因子類似物為甲基紫精(methyl viologen，MV)及其衍生物，通過在分子兩端修飾不同的基團，能夠調節(jié)輔因子類似物的還原電極電位，并改變其與不同酶之間的親和性[22-24]。

1.2 NAD(P)H非依賴型系統(tǒng)

部分CO2還原酶的分子表面含有鐵硫簇、核黃素和血紅素等“電子接收器”結構，或具有暴露的氧化還原中心?；谶@種酶搭建的系統(tǒng)可以擺脫NAD(P)H的限制[25]，這類系統(tǒng)的電子轉移機制分為兩類：當酶與電極之間的距離很近時，電極上的電子直接通過隧穿效應到達酶的“電子接收器”或氧化還原中心部分，稱為直接電子轉移(DET)；當酶與電極之間的距離較遠時，使用人工電子介體在電極與酶的“電子接收器”或氧化還原中心之間穿梭遞送電子，稱為間接電子轉移(MET)。根據(jù)Marcus電荷轉移理論，為了保證酶的活性結構與電極之間發(fā)生電子隧穿，二者距離應小于1.4 nm[26]。因此，在直接電子轉移系統(tǒng)中，必須采用固定化手段將酶負載在電極表面，但酶的用量會受到電極面積的限制，同時,在DET體系中，界面電子轉移率通常較低。

電子介體(如2,2′-聯(lián)吡啶和4,4′-聯(lián)吡啶衍生物)能夠介導酶與陰極間的電子轉移，構成MET系統(tǒng)。如，Choi等[27]利用甲基紫精在陰極和甲酸脫氫酶之間的穿梭電子，在5 h內生產了6 mmol/L甲酸鹽。Sakai等[28]通過在炭黑修飾的電極上吸附來自Methylobacterium extorquensAM1的甲酸脫氫酶(FDH)MeFDH，以合成的1,1′-三亞甲基-2,2′-二溴聯(lián)吡啶(TQ)作為高效的電子傳遞介體，成功制備了氣體擴散型生物陰極，用于CO2與甲酸的相互轉化;同時發(fā)現(xiàn)，電極的疏水性在構建氣體擴散型陰極系統(tǒng)中起關鍵作用，因為它會影響吸附的FDH與可溶性TQ之間的相互作用。此外，典型的介體分子還包括有二茂鈷、醌類和吩噻嗪類等。

2 電-酶偶聯(lián)催化轉化CO2的研究進展

目前，在酶促電催化系統(tǒng)中用于直接轉化CO2的酶包括碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)、一氧化碳脫氫酶(carbon monoxide dehydrogenase，CODH)、甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)、氮酶以及巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(crotonyl-CoA carboxylases/reductase，Ccr)等。這些酶系統(tǒng)還原CO2的反應式見表2。此外，國內外研究者還構建了豐富的多酶級聯(lián)系統(tǒng)，以進一步利用還原產品，生成更多高附加值化學品。常見的多酶級聯(lián)系統(tǒng)為FDH、甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)aldDH)和醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)組成的三酶級聯(lián)系統(tǒng)，可將CO2催化轉化為甲醇。也有一些研究者致力于開發(fā)酶促電催化CO2還原的多酶級聯(lián)新途徑，將CO2還原的初級產品進一步轉化為C6藥物前體[29]和氨基酸[30]等。

表2 用于直接CO2轉化的酶及反應式

2.1 單酶與電極間相互作用的解析

FDH和CODH是最早發(fā)現(xiàn)的能夠利用電能催化CO2和甲酸、CO2和CO可逆轉化的酶。在早期的工作中，研究人員通過向電解液中添加甲基紫精，使之穿梭于電極和酶的氧化還原中心之間傳遞電子[31-32]。循環(huán)伏安法(CV)是研究電極與酶之間電子傳輸機制的有效手段。2007年，Armstrong團隊的Parkin等[33]發(fā)現(xiàn)，Carboxydothermus hydrogenform來源的Ni-CODH Ⅰ對CO/CO2之間相互轉化的氧化和還原反應都表現(xiàn)出強烈的電催化活性;研究不同pH和溫度下的CV曲線后發(fā)現(xiàn)，Ni-CODH Ⅰ催化CO2/CO氧化還原循環(huán)具有電化學可逆特征。隨后Hirst團隊先后建立起基于W-/Mo-FDH直接電子轉移的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)[34-35]，并提出酶與電極間的電子轉移可能是依靠鐵硫簇完成的。但在單個循環(huán)伏安實驗中，由于酶的解吸或變性，電流隨著時間的延長而降低。

Sakai等[36]將FDH引入介孔碳電極的孔道中，通過循環(huán)伏安測試發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DH同時表現(xiàn)出直接和間接電子轉移的特征，這是由于靠近酶表面的鐵硫簇與電極孔道發(fā)生相互作用，直接電子轉移通信增強，而間接電子轉移過程的氧化還原則由部分解離的黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)介導，兩種過程共同促進CO2的還原。

蛋白膜伏安法(protein-film voltammetry，PFV)是由Armstrong等[37]開發(fā)的專門研究蛋白質氧化還原電化學的技術，該技術依賴于吸附在電極上的活性蛋白質單層薄膜，且蛋白中應至少有一處氧化還原輔因子與電極緊密結合，以使蛋白質中的活性位點能夠與電極進行電子交換[38]。通過向蛋白質薄膜電極施加受控電極電勢，可以使用各種伏安技術表征蛋白質的氧化還原特征，獲取目標蛋白的多種熱力學和動力學信息，從而解析復雜的電子轉移機制[39]。Li等[25]通過蛋白質膜伏安法首次明確了來源于Clostridium ljungdahlii的W-FDH中[4Fe-4S]2+/+簇的還原和氧化特征，穩(wěn)定的蛋白質膜與快速的電子轉移使該系統(tǒng)的轉化頻率(TOF)達到了1 210 s-1。

將PFV與石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)、原子力顯微鏡(atomic forcemicroscope，AFM)和衰減全反射紅外光譜(attenuated total refraction infrared spectroscopy，ATR-IR)等技術相結合，能夠更清晰地解析酶和電極之間的相互作用。Lacey團隊的Alvarez-Malmagro等[40]通過酰胺鍵將來源于Desulfovibrio vulgarisHildenborough的甲酸脫氫酶(DvH-FDH)共價固定在金電極和低密度石墨電極表面，并通過修飾電極上的帶電基團調節(jié)酶的取向(圖2)，經(jīng)AFM和QCM分析發(fā)現(xiàn)：DvH-FDHs在電極表面形成了緊密錨定的蛋白層；在電解液中加入芐基紫精后，電化學測試能夠同時檢測到直接和間接電子轉移的電流，其中基于間接電子轉移的催化電流明顯高于直接電子轉移的，因此他們認為，除與電極直接接觸的單層酶以外，電極頂部仍有許多交聯(lián)酶分子，這些酶分子只能通過電子介體實現(xiàn)催化作用。以Lacey團隊的研究為基礎，F(xiàn)era等[41]近期設計了4-氨基苯基修飾的多壁碳納米管電極，并將DvH-FDH通過靜電作用吸附在電極表面，形成了以利于電子傳輸?shù)娜∠?，同時進一步使用聚乙烯亞胺穩(wěn)定了這種取向，結果發(fā)現(xiàn)：多壁碳納米管的引入提高了電化學活性面積，PEI則通過保護酶和增加局部CO2濃度兩種效應提高了催化電流，催化電流密度達-230 μA/cm2，能夠連續(xù)運行11 h。

圖2 使用帶電基團調節(jié)酶的取向[40]Fig.2 Using charged groups to modify the orientation of enzyme[40]

除了電子轉移方式外，酶與電極間的結合作用力也能通過PFV和QCM等方法聯(lián)合表征。Reisner團隊的Miller 等[42]通過蛋白質膜伏安法觀察到了固定在介孔摻銦氧化錫(ITO)和介孔TiO2電極上的DvH-FDH中[4Fe-4S]簇高效的電荷轉移；進一步用QCM分析了酶與介孔TiO2在不同緩沖液離子強度下的相互作用強度后發(fā)現(xiàn)，隨著緩沖液離子強度的增加，仍有70%～60%的酶被吸附，證明了FDH與電極之間存在比靜電相互作用更強的親和力；同時，用ATR-IR驗證了吸附態(tài)FDH骨架結構的穩(wěn)態(tài)。2022年，Reisner團隊的Badiani等[43]以一系列帶電和中性的自組裝單分子層來修飾金電極，賦予電極不同的氫鍵供體能力，并使用QCM分析蛋白質膜在不同氫鍵作用力下的損失后發(fā)現(xiàn)，酶與電極之間DET活性下降的主要是由酶的解吸損失引起的，而僅靠靜電作用不足以防止這種損失；同時發(fā)現(xiàn)，如氫鍵作用力等靜電作用以外的非共價相互作用對穩(wěn)定蛋白質膜有重要影響，該結果為建立酶-電極界面提供了理論支持(圖3)。此外，Badiani等[44]還構建了具有正電(—NHMe2+)和負電(—COO-)基團修飾的碳納米管/碳量子點材料，使得吸附在電極上的酶存在不同的取向，以研究材料表面工程對酶的結合和催化CO2還原的影響，結果發(fā)現(xiàn)：當使用正電修飾的碳納米管時，CO2和甲酸可逆轉化的電流遠遠高于使用帶負電的碳納米管；向溶液中添加甲基紫精后，后者才能檢測到催化電流，表明當電極帶負電時，酶的鐵硫簇定位在電極的遠端，二者之間的電子交換只能通過電子介體來完成。

圖3 酶與電極間的非共價相互作用[43]Fig.3 Non-covalent interaction between enzyme and electrode[43]

2.2 合理構架電極，提升能量傳遞效率

NADH依賴型甲酸脫氫酶由于其來源廣泛并且高度耐氧而備受關注，然而受限于NADH的應用成本，該類系統(tǒng)難以投入工業(yè)規(guī)模的長期生產。電化學催化是一種經(jīng)濟、綠色的NADH再生方法，在此過程中，具有催化活性位點的陰極材料在外加電位的驅動下，催化NAD+的煙酰胺部分加2e-和1H+，生成還原型的NADH。為了實現(xiàn)電催化NADH再生，常用的策略是在電極基底上修飾聚中性紅[45-48]、Rh復合物電子介體[49-51]，或向溶液中添加甲基紫精[52]、中性紅[53-54]等游離的電子介體。此外，Cu基材料也作為NADH再生的電催化劑應用在電-酶偶聯(lián)CO2還原體系中。2018年，Barin等[55]使用泡沫銅電極還原NAD+，能夠在240 min內將大部分NAD+還原為NADH。2019年，Song等[56]將Cu納米顆粒沉積在碳氈上，結果發(fā)現(xiàn)：該電極催化NADH再生的性能高于泡沫Cu；為了提高NADH在電極與酶之間的穿梭效率，利用Cu納米顆粒與酶表面半胱氨酸殘基的配位作用將酶固定在電極上，同時連接聚乙二醇擺臂與NADH，以限制NADH的擴散范圍(圖4(a))。

圖4 銅納米顆粒催化和FNR介導的NADH再生系統(tǒng)Fig.4 Cu nanoparticle catalyzed and FNR-mediated NADH regeneration system

鐵氧還原蛋白-NADP+還原酶(ferredoxin NADP+reductase，F(xiàn)NR)在天然光合作用中承擔著光反應電子轉移的最后一步——將NADP+還原為NADPH[57]，通過將FNR固定在電極上，能夠介導NADPH的再生。Morello等[58]設計了具有納米孔道的ITO電極，在該電極上同時限域固定了FNR以及NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)，其中FNR負責接收電子、催化NADPH再生，而ME則承擔著CO2同化的功能，最終將CO2和丙酮酸轉化為蘋果酸(圖4(b))。2021年，Castaeda-Losada等[59]在氧化還原水凝膠內共固定FNR與巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶，實現(xiàn)了NADPH的循環(huán)再生和巴豆酰輔酶A分子β位的立體選擇性羧化，最終的法拉第效率高達92%±6%。

NAD(P)H非依賴型的酶通過鐵硫簇等輔因子基團與電極交換電子，當酶被固定化時，酶的氧化還原中心或電活性輔因子必須朝向電極才能發(fā)生有效電子傳遞[60]，為消除蛋白與電極間的非電活性接觸，研究人員開發(fā)了用于固定化酶的氧化還原活性聚合物。這種聚合物將酶包封在電極上，在蛋白四周形成緊密的三維電子傳導層，將電極上提供的電子運送到酶的活性位點。

Milton團隊的Yuan等[20]設計了一種含有二茂鈷(cobaltocene，Cc)結構的低電位氧化還原聚合物用于固定Escherichia coli來源的Mo-FDH,結果發(fā)現(xiàn)：通過對聚合物施加-0.66 VvsSHE的電壓，Mo-FDH無須利用電子介體就能保持連續(xù)的CO2還原活性，在經(jīng)過500次連續(xù)CV掃描之后，還原峰電流下降幅度不到5%。Kuk等[61]則采用了無金屬離子的導電聚苯胺水凝膠固定Clostridium ljungdahlii來源的 W-FDH，結果發(fā)現(xiàn)：聚苯胺水凝膠電極連續(xù)分層的大表面積納米纖維網(wǎng)絡賦予該電極較短的電子擴散長度和納米尺度的開放通道，在提升酶載量的同時保證了電子遞送和底物產物擴散；體系將CO2轉化為甲酸的過電位低至40 mV，法拉第效率為92.7%。

由于CO2還原過程通常伴隨著質子的快速消耗，電極局部pH與主體相pH往往會產生巨大差異。因此，在設計電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)時，應當考慮電極局部微環(huán)境的快速變化對酶活的影響。設計合適的緩沖策略，可使酶在電解池中催化作用更高效。最近，Reisner團隊的Edwardes Moore等[62]基于生物電催化的有限元模擬(finite element model，F(xiàn)EM)對多孔電極內的局部微環(huán)境進行了深度研究，結果發(fā)現(xiàn)：通過調整電解液、pH和pKa，可獲得酶催化的最佳孔內局部pH；大孔電極具有利于H+傳質的優(yōu)點，將電-酶偶聯(lián)生成甲酸的催化活性提高了18倍。遵循這一思路，該團隊的Cobb等[63]構建FDH@介孔電極體系，通過研究碳酸酐酶催化密閉環(huán)境中CO2的水合動力學，輔以有限元分析和電化學測定確定了共固定化碳酸酐酶在該體系中發(fā)揮的作用：①通過催化CO2和HCO-3的相互轉化緩沖局部pH；②調節(jié)CO2和HCO-3的濃度。近期，Cobb等[64]基于上述成果設計了模擬藍藻羧化體的碳酸酐酶-甲酸脫氫酶共固定化系統(tǒng)，通過使用Good′s緩沖液做電解液來替代碳酸酐酶緩沖局部pH的作用，使所有溶解的碳都能被轉化為電-酶催化的底物CO2，而處在最佳局部pH微環(huán)境中的甲酸脫氫酶則將CO2完全還原為甲酸。該體系最終實現(xiàn)了大氣濃度CO2(12 μmol/L)的直接轉化。

最近，Moreno等[65]從工作電壓、電解液溶解O2量和系統(tǒng)pH穩(wěn)定性3個方面進行優(yōu)化，使電-FDH酶偶聯(lián)催化轉化CO2系統(tǒng)達到最佳工作狀態(tài)：首先，優(yōu)化了電解池的整體電壓以實現(xiàn)最高的庫倫效率；然后，引入O2清除劑Na2S2O3以減少由于O2還原產生的額外電流；最后，搭建了pH反饋回路，通過引入pH泵緩沖反應過程中的pH變化，實現(xiàn)了整體系統(tǒng)性能最大化，在-0.85 VvsAg/AgCl電壓條件下，甲酸生產強度率達5 mol/(L·h)。

由于電催化CO2還原反應的底物常以氣體形式通入電解池，某些產物(如CO和乙烯等)也以氣體形式擴散，所以可使用氣體擴散層來增強傳質有利于氣-液-固三相界面接觸，增強催化電流[66-67]。如，Szczesny等[68]設計了一種低電位紫精基氧化還原聚合物，該聚合物將W-FDH固定在電極上，而聚合物/酶層則裝載在氣體擴散層上，這種設計保證了酶與電極間的電子傳遞，并且在運行長達45 h后仍保留了80%以上的活性；同時，氣體擴散層的引入使氣態(tài)CO2直接作為酶催化的底物，有效克服了氣-液-固界面?zhèn)髻|阻礙，電流明顯高于直接鼓泡的情況。同樣，Becker等[69]針對基于CODH的電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)設計了氣體擴散電極，利用二茂鈷基低電位氧化還原聚合物固定來源于Carboxydothermus hydrogenoformans的CODH Ⅱ，催化電流密度高達-5.5 mA/cm2，電極活性的半衰期超過20 h(圖5(a))。

圖5 氣體擴散電極固定化酶及其對應體系的CV曲線Fig.5 Schematic diagram of immobilized enzyme with gas diffusion electrode and its CV curve of corresponding system

使用一氧化碳脫氫酶時，引入氣體擴散電極依然十分有利。Contaldo等[70]將Rhodospirillum rubrum中RrCODH的結構基因cooS、cooC、cooT和cooJ在E.coli中重組表達，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳一步純化得到高純度的RrCODH，在實驗環(huán)境條件下，RrCODH具有顯著的活性；然后通過疏水相互作用將RrCODH固定在1-芘丁酸金剛烷酰胺修飾的多壁碳納米管電極上，在專門設計的CO2/CO氣體擴散電解池中，可實現(xiàn)選擇性CO2/CO相互轉換，轉化數(shù)(TON)超過80萬，并能穩(wěn)定運行1 h以上。為了進一步穩(wěn)定酶與電極的結合，Contaldo等[71]合成了一種含有Ni中心的固定分子，使用His-tag將重組RrCODH固定在碳納米管上，結果發(fā)現(xiàn)：在氣體擴散生物電極上，生物催化電流達到毫安級，實現(xiàn)了高度穩(wěn)定的CO2還原(圖5(b))，這種設計使RrCODH在催化過程中對氧的耐受性有所提高，在接近零過電位的情況下，TON超過了60萬。

2.3 固定化酶技術提高催化穩(wěn)定性

電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)的另一個挑戰(zhàn)在于生物酶蛋白本身的脆弱性，為了保證系統(tǒng)的穩(wěn)定運行，采用固定化酶技術能夠最大程度保持酶的原有結構，減弱局部電場和外界有害物質對酶造成的損傷。

晶態(tài)多孔材料(crystalline porous material，CPM)主要包括沸石、金屬有機骨架(MOF)和共價有機骨架(COF)等材料[72]。由于晶態(tài)多孔材料結構的多樣性、均勻可控的孔徑和超高的孔隙率，在固定化酶領域擁有巨大的應用潛力[73-74]。

Liu等[53]設計了基于NADH再生的電酶偶聯(lián)CO2還原體系，NADH再生過程由中性紅介導，F(xiàn)DH則固定在聚乙烯亞胺修飾的有序介孔分子篩SBA-15孔道中，結果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)固定化的酶催化3 h后的甲酸產量是游離酶的3.7倍；在12個循環(huán)后，體系仍保留了80%以上的活性。NU-1006是一種大孔Zr基金屬有機骨架材料，其孔徑高達6.2 nm，足以容納甲酸脫氫酶[75]。Farha團隊的Chen等[51]使用NU-1006來固定酶，通過結合Rh復合物修飾的電極以循環(huán)再生NADH，甲酸的產量與運行穩(wěn)定性都有了很大的提升。

金屬有機骨架UiO-66-NH2具有大比表面積和微孔結構，其孔徑更接近CO2的動力學分子直徑(0.35 ～0.51 nm)，常常被用于CO2的分離和捕集[76-77]，所以使用UiO-66-NH2來固定酶，有助于在酶催化之前預先富集CO2底物分子，從而提高底物濃度。然而，UiO-66-NH2的孔徑較小，無法直接將酶吸附在孔道內。Jiang團隊的Yan等[52]使用合成后配體替代(post-synthetic ligand substitution,PSLS)策略，利用末端配體取代橋接配體向UiO-66-NH2中引入了介孔，并保留原來的部分微孔，形成分級結構，同時保證了MOF將酶固定化和CO2捕集的功能。該系統(tǒng)可利用甲基紫精傳遞來自陰極的電子為固定化的FDH循環(huán)提供NADH，經(jīng)優(yōu)化后體系反應3 h的甲酸產量為游離酶的5.57倍，而且72 h后殘余酶活保持為初始酶活的70%以上；隨后，該團隊開發(fā)了另一種用于電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)的FDH固定化策略，通過靜電作用將FDH預先吸附在聚乙烯亞胺修飾的SiO2納米花載體上，再進一步包覆ZIF-8形成核殼狀結構，這不僅有效防止酶從載體中泄漏，而且ZIF-8的咪唑基團同樣對CO2有親和力，起到預先富集的作用。

Jiang團隊的工作為MOF材料在甲酸脫氫酶固定化中的應用提供了有價值的參考，但是MOF材料提升電-酶偶聯(lián)酶催化效率的機制尚未被解析出來。最近，Yang團隊的Jia等[78]使用ZIF-8將來源于Candida boidinii的FDH包封在電極上(圖6)，結果發(fā)現(xiàn)：ZIF-8的存在增加了電極的疏水性和CO2親和力，最終使甲酸的生產速率比僅使用酶的組別高28倍；原位衰減全反射表面增強紅外吸收光譜(attenuated total reflectance surface-enhanced infrared absorption spectroscopy，ATR-SEIRAS)揭示了反應過程中的關鍵中間體OCHO*(圖6(e))，理論模擬表明，ZIF-8中的2-甲基咪唑基團起著類似于輔酶的作用，能夠有效調節(jié)酶催化位點中纈氨酸的活性，降低基于OCHO*過程的過電位，在-1.1 VvsAg/AgCl的外加電壓條件下，復合體系的甲酸產量高達103.9 mmol/(L·h)，遠遠高于僅使用ZIF-8和僅使用FDH的組別(圖6(d))。

圖6 ZIF-8包封的FDH電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)、表征及甲酸產量[78]Fig.6 Schematic diagram of ZIF-8 encapsulated FDH characterization and formic acid production[78]

2.4 設計電-酶偶聯(lián)新途徑，合成高價值產品

除甲酸脫氫酶、一氧化碳脫氫酶和巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶外，尋找和開發(fā)新型生物酶催化劑將為CO2催化轉化開拓新方向，進一步提升催化體系的工業(yè)應用價值。氮酶的生理功能是將N2還原為NH3，該過程的活化能壘與某些CO2還原反應的能壘相似，故而在特定的非生理條件下，氮酶也能用于催化CO2的還原[79]。2012年，Yang等[80]發(fā)現(xiàn)，MoFe-氮酶的雙突變體(α-70Val→Ala、α-195His→Gln)具有催化CO2生成甲烷以及還原偶聯(lián)催化CO2和乙炔生成丙烯的能力。2016年，該團隊的Khadka等[81]進一步揭示了氮酶催化CO2還原為甲酸、CO和甲烷的3種作用途徑：通過Fe-H的直接氫化物轉移，CO2更容易生成甲酸，而當CO2中的C原子直接吸附在Fe位點上時，則更容易生成CO和CH4。2018年，Seefeldt團隊的Hu等[82]構建了基于氮酶的電-酶偶聯(lián)CO2轉化系統(tǒng)，使用茂鈷基聚合物介導電極向MoFe-或FeFe-氮酶的電子轉移，結果發(fā)現(xiàn)，二者催化CO2轉化為甲酸的法拉第效率分別為9%和32%。Minteer團隊的Cai等[83]則發(fā)現(xiàn)，在以二茂鈷衍生物為電子介體的條件下，來源于Azotobacter vinelandii的VFe-氮酶能夠催化C—C鍵偶聯(lián)，將CO2轉化為乙烯和丙烯，并且催化過程不需要ATP的參與。

Li等[84]通過改變氫鍵網(wǎng)絡和[4Fe-4S]簇的溶劑暴露來調節(jié)Hydrogenobacter thermophilus中鐵氧還原蛋白的還原電位，并以改造的鐵氧還原蛋白作為電子介體向2-氧代酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶(2-oxoacid：ferredoxin oxidoreductase，OFOR)遞送電子，催化乙酰輔酶A和1分子CO2轉化為丙酮酸和輔酶A，結果發(fā)現(xiàn)：當降低鐵氧還蛋白的還原電位降低時，CO2的還原反應在一定程度上能獲得更大的驅動力，TOF最大為81.3 min-1，CO2還原活性相當于625 nmol/(min·mg)。

進一步挖掘和改造CO2還原酶，擴展電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)的蛋白庫是未來的研究方向之一。引入多酶級聯(lián)系統(tǒng)直接合成高附加值化學品是人們一直以來的熱點。用于CO2催化轉化最常見的多酶途徑為甲酸脫氫酶-甲醛脫氫酶-醇脫氫酶(FDH-FaldDH-ADH)組成的三酶級聯(lián)系統(tǒng)。CO2在級聯(lián)反應中經(jīng)歷了由甲酸到甲醛再到甲醇的三步變化。然而，由于三酶級聯(lián)反應的復雜性以及該體系對NADH的高度依賴，使催化效率不高。為了提升電-酶偶聯(lián)催化效率，不同的科學家開發(fā)了不同手段。如，Addo等[47]發(fā)現(xiàn)，加入碳酸酐酶能夠加速甲醇生成。Zhang等[50]將3種酶共包封在ZIF-8中，實現(xiàn)了CO2和NADH的預濃縮，并提升了酶催化的穩(wěn)定性。Zhang等[85]采用另加入天然深共晶溶劑作為電-酶偶聯(lián)CO2轉化的共電解質策略，結果發(fā)現(xiàn)，該方法有助于提高CO2溶解度、改善酶的活性。

同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DH-FaldDH-ADH三酶級聯(lián)在大表面積電極上可以擺脫對NADH的依賴，通過直接攝取電子的方式催化CO2轉化為甲醇。Schlager等[86]利用海藻酸鹽-硅酸鹽水凝膠將酶固定在碳氈電極上，首次實現(xiàn)了無NADH的三酶級聯(lián)催化CO2制甲醇，法拉第效率約為10%，然而電子從電極到酶的傳遞機制尚不清楚。2020年，Seelajaroen等[87]利用羧基化石墨烯共價固定FDH-FaldDH-ADH三酶級聯(lián)系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)：在-1.2 VvsAg/AgCl的電壓條件下，該系統(tǒng)催化CO2還原時同樣不需要NADH的參與，法拉第效率為12%。

開發(fā)新型多酶途徑，或將酶促反應與其他反應級聯(lián)提升CO2還原體系配置的靈活性，生產更豐富、更高價值的產品，是構建電-酶偶聯(lián)催化轉化CO2系統(tǒng)的發(fā)展趨勢之一，包括：①電催化CO2還原-多酶催化偶聯(lián)；②電-酶催化CO2還原-微生物發(fā)酵偶聯(lián)；③復雜多酶電催化CO2還原系統(tǒng)。

Ren團隊的Jack等[29]構建了由CO2到乙醇再到C6藥物前體的轉化系統(tǒng)：第一步反應由Cu基電催化劑實現(xiàn)催化還原CO2，生成的乙醇經(jīng)過精餾純化被輸送到多酶反應器中；在酶反應器中，醇脫氫酶首先將乙醇轉化為乙醛，隨后3分子乙醛被2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(2-deoxyribose-5-phosphate aldolase，DERA)利用，合成2,4-二脫氧己糖衍生物；反應24 h后，目標產品高達632～712 mg/L，平均轉化率為38%(圖7(a))。Chen等[88]驗證了電-酶催化CO2還原-微生物發(fā)酵偶聯(lián)的可行性(圖7(b))：利用中性紅(NR)介導NADH再生，輔助甲酸脫氫酶(FDH)將CO2轉化為甲酸，并在電解池中共培養(yǎng)了工程菌Ralstonia eutropha，利用甲酸和CO2生產聚(3-羥基丁酸酯)(PHB)；在-0.6 VvsAg/AgCl的條件下，該系統(tǒng)可生成(485±13) mg/L PHB，是對照組(不添加FDH和NR)的3倍。由此可見，中性紅在體系中不僅作為催化NADH再生的電子介體，還作為細菌的跨膜電子穿梭載體，將電子直接傳遞到微生物細胞中，增加胞內還原力。

圖7 電-酶偶聯(lián)催化轉化CO2還原系統(tǒng)Fig.7 Electrocatalytic-enzymatic hybrid systems for CO2 reduction

近期，Zhu團隊的Wu等[30]利用CO2和NH3為唯一碳源和氮源合成甘氨酸的體外復雜多酶電催化CO2還原系統(tǒng)(圖7(c))。該系統(tǒng)依據(jù)反應過程中所需的NAD(P)H由Cu基電極再生，并且加入了多磷酸激酶，通過犧牲多磷酸(poly P)再生ATP。整個過程主要包括3個模塊的酶促反應：①FDH還原CO2為甲酸；②甲酸依次被甲酸-四氫葉酸連接酶、甲基四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶催化轉化為5,10-亞甲基四氫葉酸；③甘氨酸裂解系統(tǒng)的4種內源酶將5,10-亞甲基四氫葉酸與外源的CO2和NH3縮合生成甘氨酸，四氫葉酸被釋放出來。由于電能主要用于NAD(P)H的再生，該系統(tǒng)的法拉第最高可達到96.8%，甘氨酸的生產強度達8.69 mg/(L·h)。

3 結論與展望

電-酶偶聯(lián)催化CO2還原系統(tǒng)利用可再生的電能為酶促CO2還原反應提供能量，可實現(xiàn)由電能向化學能的轉化，從而獲得更高的效率和多樣化的產品。根據(jù)電子轉移方式的不同，電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)可以分為NAD(P)H非依賴型和NAD(P)H依賴型系統(tǒng)。前者的酶通過直接或間接的方式與電極交換電子，而后者則通過電催化NAD(P)H再生反應為酶提供還原力。本文從電極與酶的互作、電極的理性設計以及新型電-酶偶聯(lián)系統(tǒng)三個方面對該領域的研究進展進行了系統(tǒng)總結，但該類體系仍處于基礎研究階段，面臨著許多挑戰(zhàn)。

1)不管是單酶還是多酶系統(tǒng)，在投入電解池之前都需要經(jīng)過繁瑣的分離純化過程，開發(fā)更加簡易、系統(tǒng)性的目標酶分離純化方法對于降低成本、達到規(guī)?；a非常重要。

2)目前應用于電-酶偶聯(lián)催化CO2還原的酶種類較少，在通過蛋白質工程手段優(yōu)化已知酶的催化效率、氧耐受性和催化穩(wěn)定性的同時，還需要探索新的生物酶催化劑，建立和拓展CO2還原酶庫。

3)由于CO2的溶解度較低，不利于酶催化反應，因此，需要設計新型的電極和反應器，以實現(xiàn)CO2的原位富集，為CO2的高效轉化提供保障。

4)人工電催化系統(tǒng)與酶之間存在相容性差的問題，酶在電解液中容易失活，并且存在動力學不匹配的挑戰(zhàn)。因此，應進一步改善電解池配置，采用分池設計等方法，優(yōu)化兩者之間的耦合適配。

總之，隨著新型電-酶偶聯(lián)CO2還原系統(tǒng)的不斷優(yōu)化以及新型多酶途徑的開發(fā)，有望實現(xiàn)以CO2為原料合成各類化學品，這將在能源、化工、醫(yī)藥和食品等多個領域多個層次上拓展第三代生物制造的應用，為實現(xiàn)“碳達峰”“碳中和”的戰(zhàn)略目標提供助力。

僅以此文獻給尊敬的歐陽平凱院士！