楊 東

經(jīng)斷調(diào)理丸處方是由名老中醫(yī)專家王光輝主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗化裁而成，由牡丹皮、女貞子、墨旱蓮、生地黃、熟地黃等15 味中藥組成。經(jīng)斷調(diào)理丸具有滋腎潛陽、清心平肝的功效，臨床常用于更年期綜合征兼腎陰虧虛、心肝火旺證的治療。女貞子、墨旱蓮均歸肝、腎經(jīng)，常配伍使用起補益肝腎的作用[1-2]。文獻[3-4]報道，女貞子和墨旱蓮配伍，可明顯影響更年期大鼠的激素和脂代謝水平，并能治療女性絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥和激素缺乏導致的肥胖癥。生地黃味甘，性寒，熟地黃味甘，性微溫，兩者配伍用于肝血虧虛、腎陰不足證[5-6]。牡丹皮、合歡皮和丹參合用起清心平肝、解郁安神之功[7-9]。牡丹皮主要有效成分是丹皮酚，高效液相色譜法（HPLC）含量測定常作為含牡丹皮中成藥的質(zhì)量控制標準[10]。為對經(jīng)斷調(diào)理丸的質(zhì)量進行有效控制，本研究擬建立墨旱蓮、合歡皮的顯微鑒別，女貞子、丹參的薄層鑒別，以HPLC 測定牡丹皮的主要成分丹皮酚的含量為定量鑒別，以期建立可靠穩(wěn)定的經(jīng)斷調(diào)理丸質(zhì)量控制標準。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

女貞子對照藥材（批號：121041-201905）；齊墩果酸對照品（批號：110709-201808，含量：91.7%）；丹皮酚對照品（批號：110708-201908，含量：99.9%）；丹酚酸B 對照品（批號：111562-201917，含量：92.24%）；經(jīng)斷調(diào)理丸（本院自制，每包裝9 g，批號：211011、211012、211013）；色譜純甲醇，其他試劑選用分析純。

1.2 儀器

LC20A 型高效液相色譜儀、ATY124 型分析天平（島津科技有限公司）；IX53 型奧林巴斯顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）；HH 型電熱恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）；AB135-S 型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；硅膠G板（煙臺市化學工業(yè)研究所）；HS3120 型超聲波提取器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研成細粉，取少量涂勻載玻片，加水合氯醛1 滴，涂勻透化后置于顯微鏡下觀察。由圖1 可見，墨旱蓮多為3 細胞非腺毛，長260～700 μm，其中基部細胞稍膨大，中部細胞較長，壁厚，且有明顯突起呈疣狀，頂端細胞近三角形，形狀急尖而短。由圖2 可知，合歡皮的纖維細長成束，直徑范圍在7～22 μm，草酸鈣方晶分散于周圍細胞中并形成晶纖維，含晶細胞壁木化或微木化，增厚且不均勻。

圖1 墨旱蓮的顯微鑒別（非腺毛）

圖2 合歡皮的顯微鑒別（晶纖維）

2.2 薄層鑒別

2.2.1 女貞子的薄層鑒別 取適量的經(jīng)斷調(diào)理丸，研成細粉，取約10 g，置錐形瓶中，加甲醇20 ml，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，用無水乙醇-三氯甲烷（3∶2）混合溶液1 ml 溶解殘渣，得到供試品溶液。取女貞子對照藥材粉末1 g，按上法制成對照藥材溶液。按經(jīng)斷調(diào)理丸處方比例取缺女貞子的其他藥材，根據(jù)制備工藝制成去除女貞子的陰性對照品粉末，相同方法制備去除女貞子的陰性對照溶液。取適量齊墩果酸對照品，加甲醇溶解，得到濃度為1 mg/ml 的齊墩果酸對照品溶液。以上溶液各吸取5 μl，點樣于同一硅膠G 薄層板上，選擇環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）展開劑，展開至距薄層板上沿1.5 cm 處時取出晾干后，10%硫酸乙醇溶液顯色，置于105 ℃干燥箱中，至斑點清晰顯色。由圖3 可知，經(jīng)斷調(diào)理丸供試品薄層色譜中，女貞子對照藥材與齊墩果酸對照品有相同的顯色斑點，而缺女貞子陰性對照品無顯色斑點。

圖3 女貞子的薄層色譜

2.2.2 丹參的薄層鑒別 取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研成細粉，取約20 g，置錐形瓶中，加75%甲醇50 ml，超聲40 min，濾過，將濾液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。按經(jīng)斷調(diào)理丸處方比例取缺丹參的其他藥材，根據(jù)制備工藝制得除丹參的陰性對照品，按上述方法制成陰性對照溶液。取丹酚酸B 對照品，溶于75%甲醇，制得2 mg/ml 的丹酚酸B 對照品溶液。吸取以上溶液各5 μl，點樣于同一硅膠G 薄層板上，選擇甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，展開至距薄層板上沿1.5 cm 處取出，于陰涼處晾干，在254 nm 波長紫外光下檢視。由圖4 可知，在薄層色譜板的相應位置上，經(jīng)斷調(diào)理丸供試品與丹酚酸B 對照品有相同的顯色斑點，而陰性對照品無顯色斑點[11]。

圖4 丹參的薄層色譜

2.3 丹皮酚含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取適量的丹皮酚對照品，精密稱定，甲醇溶解制備丹皮酚對照品溶液，濃度為0.124 8 mg/ml。精密量取5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得丹皮酚對照品溶液[12]，濃度為24.96 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備 取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研細，精密稱定1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞稱重，超聲提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干錐形瓶放冷，甲醇補足失重，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 制備不含牡丹皮的經(jīng)斷調(diào)理丸其他藥材粉末，精密稱定1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞稱重，超聲提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干錐形瓶放冷，甲醇補足失重，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（38∶62）為流動相；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min。

2.3.5 專屬性考察 分別取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液，在2.3.4 項下色譜條件測定，記錄色譜圖。在“2.3.4”項下色譜條件，由圖5～7 可知：在相同的保留時間位置上供試品溶液與丹皮酚對照品溶液有相應的色譜峰，而陰性對照溶液色譜中則無此色譜峰，說明經(jīng)斷調(diào)理丸處方中其他藥味成分對丹皮酚的測定結果無干擾。

圖5 供試品溶液的HPLC 色譜

圖6 丹皮酚對照品溶液的HPLC 色譜

圖7 陰性對照溶液的HPLC 色譜

2.3.6 線性關系的考察 精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 ml 對照品貯備溶液，均用甲醇稀釋定容至25 ml，分別得到4.99、12.48、24.96、49.92、74.88 μg/ml的對照品溶液。在“2.3.4”項下色譜條件，分別進樣，記錄峰面積[13]。縱坐標為丹皮酚對照品的峰面積（y），橫坐標為質(zhì)量濃度（x），以此進行回歸分析，得回歸方程y=54 028x+256.6，r=0.999 9。表明在4.992～74.88 μg/ml 范圍內(nèi)丹皮酚含量與峰面積具有良好的線性關系。

2.3.7 精密度試驗 在“2.3.4”項下色譜條件，對照品溶液連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積[14]。計算得丹皮酚的峰面積相對標準偏差（RSD）為0.3%（n=6）。表明本實驗所用儀器具有良好的精密度。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液室溫下分別于3、4、5、6、7、8 h 取樣，按照“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積[14]。計算得丹皮酚的峰面積RSD為0.4%（n=6），可知在室溫下供試品溶液放置8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.9 重復性試驗 稱取6 份經(jīng)斷調(diào)理丸（批號211011）各1.0 g，按照“2.3.2”項制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算丹皮酚的含量[14]。結果顯示，丹皮酚的平均含量為0.53 mg/ml，RSD 為1.6%（n=6），表明方法具有良好的重復性。

2.3.10 加樣回收率試驗 取經(jīng)斷調(diào)理丸（批號211011）適量，粉碎，稱取6 份，每份精密稱定0.5 g，分別置于具塞錐形瓶，加入濃度為0.124 8 mg/ml 丹皮酚對照品貯備溶液2 ml，加入甲醇23 ml，密塞稱重，超聲處理（300 W，50 kHz）30 min，放冷，甲醇補足失重，搖勻濾過，得到供試品溶液。按照“2.3.4”項下條件進樣測定，記錄色譜峰的峰面積并計算加樣回收率[15]。回收率均在試驗要求范圍內(nèi)，說明分析方法能夠準確測量樣品中的目標成分，并且樣品處理過程中沒有明顯的損失。RSD 為0.2%，符合要求。見表1。

表1 6 份加樣回收率試驗結果

2.3.11 含量測定 適量取3 個批次經(jīng)斷調(diào)理丸，分別按照“2.3.2”項制備供試品溶液，按照“2.3.4”項進樣測定，記錄色譜峰的峰面積并計算丹皮酚的含量，復測2 次，得到平均值。見表2。

表2 經(jīng)斷調(diào)理丸中丹皮酚含量測定結果(n=2,mg/g)

3 討論

本院經(jīng)斷調(diào)理丸的工藝是原藥材全粉入藥的加工形式。墨旱蓮、合歡皮粉末顯微特征明顯，無干擾，因此，將墨旱蓮、合歡皮顯微鑒別作為質(zhì)量控制標準之一。女貞子、丹參的薄層定性鑒別實驗，在薄層色譜板的相應位置上，供試品與對照品有相同的顯色斑點，而陰性對照品無相應顯色斑點，表明陰性對照品無干擾[16-17]。丹皮酚HPLC 分離效果好，除含牡丹皮外處方中的其他藥味無干擾；丹皮酚含量測定在4.99～74.88 μg/ml 范圍內(nèi)具有良好的線性關系；供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，加樣回收率較好，丹皮酚HPLC含量測定可列入質(zhì)量標準。本實驗方法具有成分明確、方法可行、重復性較好的特點，能夠用于檢測經(jīng)斷調(diào)理丸的有效指標，有利于經(jīng)斷調(diào)理丸的質(zhì)量保證和療效發(fā)揮，提高治療學意義，保障患者用藥安全。