馮 垚，趙 穎,2，魏小紅,2

（1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院, 甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物重點實驗室 甘肅農業(yè)大學, 甘肅 蘭州 730070）

土地鹽堿化是限制農業(yè)生產的重要環(huán)境因素之一，植物在長期適應鹽堿過程中進化出一系列的生理變化來與之響應。藜麥(Chenopodium quinoa)屬于藜科藜屬一年生四倍體雙子葉草本植物，起源于南美洲安第斯山脈[1]。其大多數(shù)品種有較強的耐鹽、耐瘠薄特性和極高的營養(yǎng)價值，且可以適應高海拔的環(huán)境，故繼青稞(Hordeum vulgare)后成為我國西北地區(qū)廣泛種植的經濟作物。但由于西北地區(qū)分布著大量的鹽堿地，加之溫室效應、灌溉不合理等原因，導致土壤鹽堿化問題愈發(fā)嚴重[2]，因此，提高藜麥對鹽堿的耐受性已成為保障藜麥高產穩(wěn)產的重要途徑。

氮素是植物重要的營養(yǎng)元素，是植物生長發(fā)育的核心元素之一，是調控植物生長發(fā)育的關鍵因素。多數(shù)植物能以硝酸鹽作為氮源，需要通過硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)把從外界吸收的氧化態(tài)NO3-還原成氨[3]，最后用于蛋白質的合成。因此NR 和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)對氮代謝的進行至關重要。然而鹽堿脅迫會降低NR 和GS 的活性，改變植物中含氮化合物的含量，最終導致對氮的吸收與利用率下降。近年來，在小麥(Triticum aestivum)[4]、黃瓜(Cuccumis sativus)[5]、水稻(Oryza sativa)[6]以及馬鈴薯(Solanum tuberosum)[7]等植物中的研究發(fā)現(xiàn)氮素與鹽堿脅迫有交互關系，植株可以通過累積體內可溶性蛋白和氨基酸等一些小分子有機物緩解鹽堿帶來的不利影響。其中可溶性蛋白除參與滲透調節(jié)外，還在一定程度上代表植物器官功能的變化；氨基酸含量的增加也能調控植物滲透勢，提高植物抗鹽堿能力，植物也可通過改善NR、GS、谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)活性等方法提高植物對鹽堿脅迫的耐受性。

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為生物體內傳遞細胞間和細胞內信息的信使分子，對提高植物抗逆性方面有重要的功能。目前已經在鹽地堿蓬(Suaeda liaotungensis)[8]和甜瓜(Cucumis melo)[9]等植物上得到驗證。然而，目前對于藜麥的抗鹽堿性研究主要集中在其單鹽的生理特性等方面，NO 調控其幼苗抗鹽堿性還鮮有報導。因此，本研究以‘隴藜4 號’為試驗材料，NO 供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)為信號物質，探討NO 對混合鹽堿脅迫下藜麥幼苗生長及氮代謝的影響，以期為揭示藜麥抗鹽機理和提高藜麥抗鹽性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方式

試驗材料采用甘肅省農業(yè)科學研究院提供的白藜麥種子‘隴藜4 號’。選取顆粒飽滿、大小均勻、重量一致、品質優(yōu)等的藜麥種子。使用濃度為10%的次氯酸鈉溶液對篩選好的藜麥種子消毒處理15～20 min[10-11]，然后用去離子水洗去殘留的次氯酸鈉溶液，清洗3 次后，將藜麥種子均勻地播種到深5 cm 的32 孔育苗托盤中(每孔一粒種子)，在溫度為25 ± 2 ℃，光照強度為4 000 lx，16 h 光培養(yǎng)/8 h暗培養(yǎng)，相對濕度為85%的環(huán)境下進行育苗[12-14]，待長至四葉一心期后，移栽到裝有500 g 的經高壓滅菌的營養(yǎng)土的花盆(φ = 20 cm，h = 14 cm)中[15]，每盆各移植5 棵藜麥幼苗，每天使用稱重法補充水分。繼續(xù)培養(yǎng)到八葉一心時期[16]，挑選出長勢一致的幼苗進行鹽堿脅迫及外源NO 處理。

本試驗混合鹽堿溶液的比例及濃度參考根據(jù)文獻[17-18]，采用兩種中性鹽(NaCl、Na2SO4)和兩種堿性鹽(NaHCO3、Na2CO3)調配成由A 到E 堿性依次 增 強 的 200 mmol·L-1混 合 鹽 堿 溶 液(表1)，外 源NO 供體SNP 濃度為150 μmol·L-1。試驗處理如下：CK (澆灌蒸餾水)；鹽堿脅迫(A、B、C、D、E)；NO；鹽堿(A、B、C、D、E) + NO，每處理重復3 次，每2 d施加80 mL 處理液(根據(jù)王寶強等[18]的試驗方法進行適當調整)，并于混合鹽堿處理后3、6、9 d 取樣測定株高、根長、生物量、根冠比、NR 活性、GS 活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量。

表1 各種處理的不同鹽分組成Table 1 Different salt compositions in various treatments

1.2 試驗測定指標與方法

1.2.1 鹽脅迫下外源NO 對藜麥幼苗生長指標的測定

每種處理選取5 盆長勢一致的藜麥幼苗進行破壞性采樣，將植株完整挖出，用去離子水洗凈根部泥土，用紙巾吸干藜麥幼苗表面水分，進行株高[19]、根長[20]的測量。將藜麥幼苗的莖、葉與根，置于烘箱中，于105 ℃恒溫30 min 后，在70 ℃的溫度下烘烤至重量恒定不變時，取出用電子秤稱量干重，莖與葉的干重之和即為地面上部生物量，根部的干重為地面下部生物量[21]。

總生物量 = 地面上部生物量 + 地面下部生物量[22]；

植株根冠比(R/S) = 地面下部生物量/地面上部生物量[23]

1.2.2 鹽脅迫下外源NO 對藜麥幼苗氮代謝相關合成酶活性和含氮化合物含量的測定

采用比色法測定樣品中NR 的活力[24]。采用三氯化鐵比色法測定樣品中GS 活性[25]。采用分光光度法測定樣品中游離氨基酸總量[26]。采用考馬斯亮藍法測定樣品中可溶性蛋白含量[27]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理及圖表制作，采用SPSS 22.0 軟件的鄧肯氏新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，差異顯著性水平為 0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗株高的影響

2.1.1 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗株高的影響

在沒有添加外源NO 處理的情況下，隨著鹽堿處理溶液pH 的上升，藜麥的株高受到明顯地抑制，伴隨著植物的生長，株高整體呈增長趨勢，伴隨著時間的推移，藜麥幼苗中鹽堿不斷堆積，受抑制程度呈現(xiàn)增強趨勢 (P< 0.05) (表2)。其中pH 為10.53(E 處理)處理9 d 時對藜麥幼苗株高生長造成的傷害最大，與CK 相比降低了22.73%。外源NO 有效緩解了混合鹽堿對藜麥幼苗的抑制作用。外源NO 對藜麥幼苗株高的生長有促進作用，尤其對鹽堿的緩解作用更明顯，且對堿性鹽的效果較中性鹽、弱堿性鹽明顯(表2)。6 d 時緩解效果最佳，其中6 d 時的pH 為9.75 (D 處理)和pH 為10.53 (E 處理)緩解效果最好，與未添加NO 的處理相比，株高分別增加了18.75%和26.00%。表明鹽堿會明顯抑制藜麥幼苗株高的生長，且會隨著鹽堿程度的增強、處理時間的推移，受抑制程度增加，外施NO 可以很好地緩解鹽堿脅迫的抑制作用。

表2 外源NO 對鹽堿脅迫下藜麥幼苗株高的影響Table 2 Effects of exogenous NO on the plant height of quinoa seedlings under saline alkali stress cm

2.1.2 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗根長的影響

隨著藜麥的生長發(fā)育，其根長呈增長趨勢。在面對不同比例的鹽堿脅迫時，初期(3 d 時)根部生長受抑，隨著處理時間增加，根長呈增長趨勢，且在pH 不超過9.18 (A、B、C 處理)時，增加趨勢更明顯。其中9 d 時pH 為8.98 (B 處理)與CK 相比變化最明顯，根長增加了78.79%，表明鹽堿脅迫下藜麥幼苗的根長在初期呈降低趨勢，隨著處理時間增加，藜麥幼苗受鹽堿脅迫的刺激作用，根長呈現(xiàn)出一定程度的增加，以緩解鹽堿對藜麥幼苗的傷害，這種現(xiàn)象在中性鹽和弱堿性(pH ≤ 9.18)鹽處理下比較明顯(表3)。在噴施NO 處理后，根長整體呈現(xiàn)出增長的趨勢，在6 d 時效果最佳(表3)。NO 對堿性鹽的效果優(yōu)于中性鹽的效果，尤其是對pH 為9.89 (D 處理)的效果最佳，在6 d 時根長相對于沒添加NO 的處理增加了111.11%，表明NO 可明顯緩解混合鹽堿對藜麥幼苗根部的抑制作用，以維持根系的生長。

2.1.3 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗生物量的影響

所有處理藜麥幼苗的生物量隨時間推移而不斷增多 (表4)。隨著鹽堿脅迫中堿性的加劇，幼苗中生物量呈下降趨勢。在9 d 時pH 為10.53 (E 處理)堿性最強時生物量下降最明顯，與CK 相比降低了61.76%。外源NO 可有效緩解鹽堿脅迫造成的傷害，提高藜麥幼苗中的生物量。經過外源NO 處理后，藜麥幼苗中的生物量呈現(xiàn)出增長的走勢。NO 對鹽堿的緩解效果整體為D > C > B > E > A，在6 d 時效果最佳C 處理和D 處理作用最明顯，分別提高了264.29%和340.00% (表4)。

2.1.4 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗根冠比的影響5 種混合鹽堿溶液處理下，藜麥幼苗的根冠比呈上升趨勢，并隨著處理時間的推移和處理溶液堿性的增強上升趨勢愈發(fā)明顯 (表5)，說明鹽堿脅迫會使藜麥幼苗的根冠比增高。其中pH 為10.53 時(E 處理)在9 d 的時變化最明顯，較CK 提高了195%。外源NO 可以有效緩解混合鹽堿脅迫對藜麥幼苗的損傷，使幼苗根冠比增加。NO 處理后，藜麥幼苗中的根冠比有明顯增加，并隨時間的推移，變化趨 勢越明顯，表現(xiàn)為C > D > E > B > A。9 d 時，pH 為9.18 (C 處理)的根冠比漲幅最明顯，較沒有添加NO 的C 處理增加了164% (表5)。

表5 外源NO 對鹽堿脅迫下藜麥幼苗根冠比的影響Table 5 Effects of exogenous NO on root to shoot ratio of quinoa seedlings under saline alkali stress

2.2 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗氮代謝相關合成酶活性以及含氮化合物含量的影響

2.2.1 對NR 活性的影響

隨著處理天數(shù)的增加，藜麥幼苗中的NR 活性呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。鹽堿脅迫會讓藜麥幼苗中NR 活性下降(6 d 的A 處理除外，與CK 相比，其NR 活性提高了18.18%)，并伴隨著鹽堿脅迫程度的加深，下降程度更加明顯。在pH ≥ 9.75 (D 處理與E 處理)時，藜麥幼苗中NR 活性降低的最明顯，與CK 相比分別降低了27.27%和29.09% (圖1)。說明鹽堿脅迫會明顯抑制幼苗中硝酸還原酶的活性，抑制程度伴隨堿性的增強而增加。A 處理說明在中性鹽的脅迫下，藜麥幼苗中NR 的活性因受鹽堿的刺激作用，使NR 活性增強，抵抗鹽堿脅迫，但隨著處理時間的增強，酶活性也呈降低趨勢。

圖1 外源NO 對鹽堿脅迫下硝酸還原酶活性的影響Figure 1 Effect of exogenous NO on nitrate reductase activity under saline alkali stress

添加NO 可以有效緩解鹽堿脅迫，對NR 活性的緩解作用隨處理時間的推移而增加，表現(xiàn)為D >B > C > E > A。施加外源NO 9 d 時，藜麥幼苗中的NR 均有明顯上升，在pH 為9.89 (D 處理)時上升了51.52%，效果最佳(圖1)。說明外源NO 對混合鹽堿脅迫存在一定的緩解作用，可有效增加藜麥幼苗中硝酸還原酶活性，尤其是在面對堿性鹽時，硝酸還原酶活性有明顯的上升。

2.2.2 對GS 活性的影響

混合鹽堿明顯降低了GS 的活性，隨時間的推移其活性逐漸下降，且與中性鹽相比，堿性鹽對GS 活性的抑制程度更明顯。說明鹽堿脅迫可明顯抑制GS 活性，抑制程度與處理液堿性強度呈正相關關系。在9 d 時，pH 為8.98 和9.89 (B 處理和D 處理)時抑制效果最明顯，GS 活性與CK 相比分別降低了73.22%和70.56% (圖2)。

圖2 外源NO 對鹽堿脅迫下藜麥幼苗中谷氨酰胺合成酶活性的影響Figure 2 Effect of exogenous NO on glutamine synthetase activity in quinoa seedlings under saline alkali stress

外源NO 處理后，對GS 活性的緩解作用隨時間推移而增加：9 d > 6 d > 3 d (圖2)。GS 活性的緩解作用表現(xiàn)為D > C > E > B > A，可以看出對堿性鹽的緩解作用優(yōu)于中性鹽。在9 d 時，外源NO 在pH 為9.89 (D 處理)時緩解作用最強，GS 活性相對沒有添加NO 的處理提高了83.08%。說明外源NO 在一定程度上可以緩解鹽堿脅迫對幼苗中GS 活性的抑制作用，增強GS 活性。

2.2.3 對可溶性蛋白含量的影響

在混合鹽堿溶液的處理下，藜麥幼苗中可溶性蛋白的含量隨時間和堿性的增強整體呈現(xiàn)上升趨勢，在鹽堿處理3 d 時，在pH 為9.18 和10.53 (C 處理和E 處理)時藜麥幼苗中可溶性蛋白的含量分別提高了22.27%和19.33%，變化最明顯(圖3)。

圖3 外源NO 對鹽堿脅迫下藜麥幼苗中可溶性蛋白含量的影響Figure 3 Effect of exogenous NO on soluble protein content in quinoa seedlings under saline alkali stress

在施加外源NO 處理后，藜麥幼苗中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出降低的趨勢，并隨著處理天數(shù)的增加，變化程度越發(fā)明顯(圖3)。表明外源NO 溶液可以減少藜麥幼苗中可溶性蛋白的含量。施加了外源NO 后，pH 為9.18 (C 處理)時，在9 d 時藜麥幼苗中可溶性蛋白含量減少量最顯著，相對降低了37.35%。

2.2.4 對游離氨基酸總含量的影響

藜麥幼苗中游離氨基酸含量受到鹽堿脅迫后會呈現(xiàn)出一定程度的上升，并且伴隨著堿性的加強、處理時間的延長游離氨基酸的含量增加量越多，這說明受鹽堿條件的影響，藜麥幼苗中游離氨基酸的含量會增加，并與堿性的強弱成反比。在鹽堿處理的下，pH 為10.53 (E 處理)在3 d 和6 d 時，藜麥幼苗中游離氨基酸的含量增加最明顯，與CK 相比分別提高了30.75%和28.67% (圖4)。

圖4 外源NO 對鹽堿脅迫下藜麥幼苗中游離氨基酸總含量變化的影響Figure 4 Effect of exogenous NO on the total content of free amino acids in quinoa seedlings under saline alkali stress

經外源NO 處理后，藜麥幼苗中游離氨基酸的含量呈現(xiàn)出明顯的增長趨勢，表現(xiàn)為D > C > E > B >A (圖4)。pH 為9.89 (D 處 理) 3 d 時 在 施 加 了 外 源NO 溶液處理后，上升幅度最大，效果最明顯，游離氨基酸含量相對未添加NO 的處理增長了47.74%。在9 d 時，pH 為9.18 (C 處理)中游離氨基酸含量增加的最明顯，相對增長了46.77%。說明外源NO 可以促進氮代謝，有利于游離氨基酸的積累。

3 討論

3.1 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗生長指標的影響

鹽脅迫會明顯影響植株的正常生長發(fā)育，主要表現(xiàn)在植物組織和器官生長方面。生長狀態(tài)是反映植物受鹽堿脅迫程度情況的一個基本指標[28]。本研究表明，不同程度的鹽堿脅迫均抑制藜麥的生長，當鹽堿濃度增加時，所表現(xiàn)出的抑制作用逐漸明顯。與在玉米(Zea mays)、水稻、櫻桃(Cerasus pseudocerasus)、番茄(Solanum lycopersicum)等植物中的研究類似[29-32]，鹽堿脅迫會明顯抑制植物的生長。本研究也發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫的條件下，藜麥幼苗的株高、根長、生物量和根冠比與對照相比有顯著變化，株高與生物量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，根長與根冠比呈現(xiàn)上升的趨勢。說明受鹽堿脅迫的影響，植物的地上部分的生物量和株高會降低，以減輕對營養(yǎng)物質的消耗，會增加自身根部的長度和生物量作為保護手段，從而增多對土壤中水分、氮源、碳源等營養(yǎng)物質的吸收，以維持植株的正常生長發(fā)育，從一定程度上抵制鹽堿脅迫。

NO 作為植物體內的信號分子，組成植株中的轉導路徑，調節(jié)植物應對環(huán)境中的生物脅迫與非生物脅迫。外源NO 對植物生長的促進作用以及其參與抗逆耐受等生理過程，目前已經在高粱(Sorghum bicolor)[33]、玉米[31]、馬鈴薯[7]等植物中被證實。本研究表明施加了外源NO 后，較好地緩解這一狀況，株高、生物量、根長和根冠比皆呈現(xiàn)出增長趨勢，NO 的緩解效果對強堿性鹽C、D 的緩解作用更強，這與劉建新等[34]在黑麥草(Lolium perenne)幼苗和吳旭紅等[35]在南瓜(Cucurbita moschata)幼苗研究中的情況一致。因此我們推測在施加了外源NO后，會增加根生組織的發(fā)育，增加養(yǎng)分的吸收，提高地上部分的發(fā)育，讓藜麥幼苗的生長狀態(tài)恢復正常水平，以緩解鹽堿脅迫帶來的土壤水勢降低、吸水困難的問題。

3.2 鹽堿脅迫下外源NO 對藜麥幼苗氮代謝相關合成酶活性以及含氮化合物含量的影響

氮代謝是植物體內的重要生理過程之一，主要通過吸收無機氮(NO3－)，同化為有機含氮化合物，提高植物在逆境中的耐受性，其中NR 和GS 的活性代表著氮代謝轉化的程度[34-37]。鹽堿脅迫會引起其活性下降，導致細胞質中反應物硝酸鹽的堆積及反應產物亞硝酸鹽含量的減少，引起氮代謝紊亂，最終影響植物的正常生命活動。本研究結果表明，在鹽堿脅迫下，藜麥幼苗中的NR 活性隨處理天數(shù)增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，NR 活性表現(xiàn)為6 d > 3 d >9 d，GS 活性隨處理時間的推移以及處理液中堿性的增強而下降，且在pH > 8.9 (B、C、D、E 處理)的堿性鹽環(huán)境中，GS 活性下降的幅度最明顯，這與劉月月等[4]在水稻中的研究相似，這說明鹽堿脅迫會抑制NR 和GS 的活性，NR 活性隨處理時間增加先增后減，對其抑制程度與pH 成正比，鹽堿脅迫會對細胞中硝酸鹽的轉化，影響NO3-的轉化利用，伴隨著pH 的變大，GS 活性被抑制的程度不斷加深，從而影響氮素同化，NO3－同化和蛋白質降解產生的N積累引起氨中毒，阻礙植物正常生命活動的進行。

在施加外源NO 后，NR 和GS 活性整體呈現(xiàn)出上升的趨勢，其中在pH 為9.75 (D 處理)時效果最佳，證明外源NO 可有效緩解鹽堿NR、GS 活性的抑制作用，且對堿性鹽的緩解作用較中性鹽明顯，這說明噴施NO 能促進鹽堿脅迫下藜麥幼苗對硝酸鹽的轉化。NR 活性越高對硝酸根的轉化效率越高，主導著作物對氮素的吸收和利用，提升氮代謝的效率，以維持作物正常的生長發(fā)育。GS 活性提升，提高對NH4＋的轉化效率，避免造成植物氨中毒，維持植物正常生理活動。

氨基酸的合成受到NR 和GS 活性的調控，與蛋白質的降解密切相關?？扇苄缘鞍资侵参矬w內氮素存在的主要形式，植物可以通過提升可溶性蛋白的含量來提高細胞的保水能力，以緩解傷害。本研究表明：伴隨著鹽堿程度的提升，藜麥幼苗中氨基酸含量不斷提高，可溶性蛋白含量呈先增后減的趨勢，說明鹽脅迫破壞了植物細胞結構，導致構成細胞的可溶性蛋白流出，可溶性蛋白的分解會產生大量的游離氨基酸，這不僅有利于植株進行滲透調節(jié)，還有益于維持植株氮代謝的正常進行，與吳旭紅等[35]對南瓜幼苗和陳明等[38]在小麥幼苗方面的試驗結果相似。施加NO 后，藜麥幼苗中可溶性蛋白含量降低，氨基酸含量整體呈上升趨勢，說明外源NO 會通過修復鹽堿脅迫所造成的氧化性損傷，加快對NO3－的轉化吸收，進而增加NR 和GS 的活性，增加游離氨基酸的積累，減少可溶性蛋白的含量，消除鹽堿脅迫下對氮代謝及相關代謝酶的毒害作用。

4 結論

鹽堿對藜麥幼苗的生長和氮代謝具有明顯的抑制作用，NR 和GS 活性顯著降低，游離氨基酸和可溶性蛋白的含量呈上升趨勢；外源NO 對鹽堿脅迫有明顯的緩解作用，可以通過增加藜麥幼苗的根長，增加對土壤中營養(yǎng)物質的吸收，從而使地上部分的生長水平趨于正常狀態(tài)；還可以加強氮代謝相關合成酶活性，使游離氨基酸含量呈現(xiàn)上升趨勢、可溶性蛋白含量呈下降趨勢，介導藜麥幼苗的氮代謝，進而有效地緩解混合鹽堿的脅迫作用，降低其對生長和氮代謝的抑制。外源NO 對D (NaCl ?Na2SO4? NaHCO3? Na2CO3= 1 ? 1 ? 1 ? 1)處理的效果最理想，但pH 超過10 后(E 處理)效果會下降，進一步說明外源NO 對堿性鹽脅迫的緩解作用效果較中性鹽更顯著，對pH 在10 左右的鹽堿作用最佳，可以明顯地緩解鹽堿對生長、氮代謝的抑制作用。