張婷婷，張鶴山，宋康杰，趙澤宇，許本波，劉 洋

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 荊州 434025；2.動(dòng)物胚胎及分子育種湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 湖北 武漢 430064）

白三葉(Trifolium repens)在世界溫帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布[1-2]，在我國(guó)西南、華中、華北、東北等地區(qū)有野生分布。白三葉適應(yīng)性強(qiáng)，蛋白含量高，適口性好，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料被人們飼喂家畜[3]，在鄂、湘、川、云、貴等省(區(qū))有大面積栽培。據(jù)統(tǒng)計(jì)，云南有一半的栽培草地混播了白三葉，湖北也建植了近4 萬(wàn)hm2的白三葉混播草地[4]。此外，白三葉生有固氮作用的根瘤，并且花期長(zhǎng)、葉形美觀，在南方草地生態(tài)建設(shè)、果園生草和景觀綠化方面亦具有很高的利用價(jià)值[5]。

分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于植物聚類(lèi)分析、種質(zhì)資源鑒定和基因定位[6-8]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)主要指在真核生物基因組非編碼區(qū)中，重復(fù)核心序列較短(1～6)而重復(fù)次數(shù)較多的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR 廣泛存在于真核生物中，是基于PCR 的共顯性標(biāo)記[9]，具有豐富的基因組水平多態(tài)性，并且在同一物種不同的種質(zhì)材料間可以高度表達(dá)[10-12]，因此，SSR 標(biāo)記被認(rèn)為是植物染色體組分析的理想技術(shù)[13]，被 廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的評(píng)估、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、系譜確定、構(gòu)建遺傳圖譜等多個(gè)領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn)SSR 分子標(biāo)記技術(shù)可簡(jiǎn)單、高效開(kāi)展遺傳多樣性和基因定位研究。國(guó)外Jones 等[14]和Barrett 等[15]分別利用78 對(duì)、365 對(duì)SSR引物標(biāo)記了135 個(gè)、493 個(gè)位點(diǎn)。國(guó)內(nèi)李莉等[16-17]利用SSR 技術(shù)分析了貴州白三葉種群和不同種質(zhì)間同一花序的多樣性，夏巖石等[18]將菜薹品質(zhì)和SSR 標(biāo)記進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，這些研究為白三葉種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用提供了技術(shù)支持。盡管如此，目前用于白三葉種質(zhì)資源研究的專(zhuān)用引物及白三葉特異性引物仍然較少，已經(jīng)制約了白三葉分子輔助育種技術(shù)的發(fā)展。鑒于此，本研究以不同花瓣顏色的白三葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法分析白三葉SSR 位點(diǎn)序列分布特征、堿基重復(fù)類(lèi)型、引物設(shè)計(jì)等信息，并開(kāi)發(fā)具有多態(tài)性的白三葉SSR 標(biāo)記，以期為白三葉遺傳信息分析、種質(zhì)資源高效鑒定及雜種優(yōu)勢(shì)利用等方面提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白三葉種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草種質(zhì)資源圃(114°10′ E，30°18′ N，海拔31 m)，在開(kāi)花期采集生長(zhǎng)良好的白三葉花瓣，3 次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后保存-80 ℃冰箱。由北京百邁客生物科技有限公司完成樣品RNA-seq 測(cè)序。

用于多態(tài)性引物篩選的白三葉種質(zhì)如表1 所列，其中來(lái)自丹麥和德國(guó)的材料各2 份，來(lái)自美國(guó)的材料4 份，來(lái)自新西蘭的材料6 份，來(lái)自英國(guó)和中國(guó)的材料各3 份。除來(lái)自于中國(guó)云南和貴州的2 個(gè)白三葉材料為野生類(lèi)型外，其他材料均為栽培品種。

表1 材料及其來(lái)源Table 1 Experimental materials and their sources

1.2 SSR 序列識(shí)別

轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 已 上 傳 至GEO (Gene Expression Omnibus database)數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為GSE101059。利用MicroSatellite (MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件定位、識(shí)別轉(zhuǎn)錄組unigene 數(shù)據(jù)中的SSR 位點(diǎn)。參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)單元1～6 bp，單堿基和二堿基的最低重復(fù)參數(shù)分別為10 次和6 次，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基最低重復(fù)5 次，SSR 位點(diǎn)兩側(cè)序列長(zhǎng)度大于50 nt。

1.3 SSR 引物設(shè)計(jì)

利 用 Primer 6.0 設(shè) 計(jì)SSR 正 向 引 物 和 反 向 引物。引物長(zhǎng)度控制為18～25 nt (堿基)，Tm 值55～65 ℃，GC 含量40%～60%，產(chǎn)物長(zhǎng)度80～300 bp。為更清晰地讀取譜帶數(shù)據(jù)，將每條引物的正向引物加上通用M13 接頭序列“TGTAAAACGACGGCC AGT”，合成含HEX 熒光基團(tuán)M13 熒光接頭引物。

1.4 PCR 擴(kuò)增體系

本研究以來(lái)自不同地區(qū)的20 個(gè)白三葉種質(zhì)為材料，從批量設(shè)計(jì)的引物中隨機(jī)選擇60 對(duì)檢測(cè)其SSR 位點(diǎn)多態(tài)性。

采用CTAB 法提取白三葉葉片總DNA[19]。以DNA 為模板，進(jìn)行三引物PCR 擴(kuò)增(反向引物、M13 接頭引物和M13 熒光接頭引物)，PCR 反應(yīng)體系中包含1 μL 模板DNA，5 μL PCR Master Mix (天一輝遠(yuǎn))，0.1 μL 正向引物，M13 接頭引物0.4 μL，0.4 μL熒光M13 引物，用ddH2O 補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 預(yù)變性5 min；分別擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)和8 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃保溫10 min。利用毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)條帶情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)類(lèi)型

白三葉SSR 位點(diǎn)總數(shù)為24 960 個(gè)，分布于20 142條序列上，平均每5.29 kb 中出現(xiàn)1 個(gè)SSR 位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為13.25%。含1 個(gè)以上SSR 位點(diǎn)的序列有3701條，含有復(fù)合SSR 位點(diǎn)的序列有1 940 條。白三葉轉(zhuǎn)錄組中共有273 種重復(fù)單元，其中，單堿基重復(fù)有兩種，即C/G 重復(fù)和A/T 重復(fù)，以A/為主，共6 202 個(gè)，出現(xiàn)頻率和平均距離也最高，分別為3.29%和21.30 kb；二堿基重復(fù)共4 種，AG/CT 重復(fù)最多，最少的是CG/CG 重復(fù)，只占二堿基重復(fù)的0.18%；三堿基重復(fù)數(shù)量最多的是AAG/CTT，出現(xiàn)頻率為1.18%；四堿基重復(fù)有27 種，有5 種只存在于1 處，最多的有189 處，即AAAT/ATTT；五堿基重復(fù)共有79 種，其中，AAAAT/ATTTT 最多，有82 處；六堿基重復(fù)的種類(lèi)最多，共有151 種，但每一種重復(fù)的數(shù)量均較少，最多的AATCAT/ATGATT 也只有22 處(表2)。在這6 種堿基重復(fù)中，種類(lèi)與數(shù)量成反比，既數(shù)量越少，但重復(fù)種類(lèi)卻更多，比如六堿基重復(fù)的數(shù)量最少，但其種類(lèi)最多。

表2 白三葉轉(zhuǎn)錄組SSR 基元類(lèi)型Table 2 Transcriptome SSR repeat types in Trifolium repens transcripts

2.2 SSR 位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)

在每一類(lèi)型堿基基元中，重復(fù)數(shù)量隨重復(fù)次數(shù)的增加而減少。單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)中，重復(fù)最多次數(shù)的數(shù)值分別為12 次、6 次和5 次，分別 有2 194 處、2 113 處 和4 620 處，占 比 分 別 為35.13%、31.16%和49.09%；四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)中，重復(fù)最多次數(shù)的數(shù)值分別為5 次、4 次和4 次，分別有532 處、655 處和520 處，占比由64.33%到79.11%最后上升至85.86%，由此可以看出，重復(fù)最多次數(shù)的數(shù)值在降低，占比卻在升高。在單堿基重復(fù)到六堿基重復(fù)的過(guò)程中，重復(fù)次數(shù)的類(lèi)型逐漸降低。單堿基重復(fù)中的重復(fù)次數(shù)有38 種類(lèi)型，二堿基和三堿基重復(fù)中的重復(fù)次數(shù)分別有37 種和23種，但四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)僅分別有12、10 和12 種(表3)。

表3 SSR 重復(fù)次數(shù)Table 3 SSR number of replications

2.3 白三葉轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)的長(zhǎng)度分布

白三葉SSR 重復(fù)片段平均長(zhǎng)度為18 bp，SSR 重復(fù)的長(zhǎng)度主要集中在12～35 bp，有24 069 條，占了總數(shù)的96.43%，其中，數(shù)量最多的為15、12 和18 bp，分 別 有5 216、4 307 和3 109 條；36～132 bp 只 有891 條，占總數(shù)的3.57%，其中，最長(zhǎng)的4 種長(zhǎng)度為92、93、126 和132 bp，只有1～2 條(圖1)。

圖1 SSR 長(zhǎng)度總的分布情況Figure 1 Distribution of total SSR length

2.4 SSR 引物設(shè)計(jì)

為了篩選出可應(yīng)用于白三葉相關(guān)分析的SSR分子標(biāo)記，利用軟件對(duì)24 960 個(gè)SSR 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表4)，共設(shè)計(jì)出18 549 對(duì)引物，長(zhǎng)度為18～28 bp，預(yù)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為80～240 bp，退火溫度為55.00～63.50 ℃，正反引物溫差不大于6 ℃。在設(shè)計(jì)的18 549 對(duì)SSR 引物中，擴(kuò)增產(chǎn)物最多的為三堿基重復(fù)，有11 589 對(duì)，占62.48%；其次是二堿基重復(fù)，有4 953 對(duì)，占26.70%；剩下4 種重復(fù)類(lèi)型設(shè)計(jì)出的引物占比均不大。盡管單堿基重復(fù)SSR 位點(diǎn)有6 246處，占總數(shù)的25.02%，但設(shè)計(jì)出的引物只有69 處，僅占所有引物的0.37%。

表4 設(shè)計(jì)的SSR 引物統(tǒng)計(jì)信息Table 4 Statistics of designed SSR primers

2.5 白三葉品種的指紋圖譜構(gòu)建

為進(jìn)一步檢驗(yàn)設(shè)計(jì)引物的有效性和實(shí)用性，本研究利用20 個(gè)不同生態(tài)背景的白三葉種質(zhì)材料對(duì)隨機(jī)選取的60 對(duì)引物的多態(tài)性進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果表明，52 對(duì)引物能擴(kuò)增出目的條帶，引物擴(kuò)增率為86.7%。將熒光PCR 產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，33 對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物能檢測(cè)到目的片段，占引物數(shù)量的63.5%，其中具有多態(tài)性位點(diǎn)的引物有17 對(duì)，占32.7%。

以篩選出的多態(tài)性引物擴(kuò)增出的毛細(xì)管峰圖為基礎(chǔ)，選取5 對(duì)具有代表性的引物ZHS11、ZHS39、ZHS41、ZHS56 和ZHS109 構(gòu)建DNA 指紋圖譜，引物信息如表5 所列。ZHS41 的144 bp、ZHS11 的214 bp、ZHS56 的230 bp 分 別 可 以 將EM10、EM17 和EM18 區(qū) 分 出 來(lái)(圖2)。EM7 和EM10 在ZHS11 的166 bp 處均有條帶，但EM7 還有178 bp、190 bp 和202 bp 條帶而EM10 沒(méi)有，因此可以把EM7 區(qū)分出來(lái)。以此類(lèi)推，這5 對(duì)引物可以將20 份白三葉品種在分子層面區(qū)別出來(lái)，說(shuō)明由這5 對(duì)引物所構(gòu)建的20 份白三葉DNA 指紋圖譜具有較強(qiáng)的鑒定、區(qū)別能力。

圖2 20 份白三葉品種的DNA 指紋圖譜Figure 2 DNA Fingerprinting of 20 white clover cultivars

表5 引物信息Table 5 SSR primer information

3 討論

SSR 的數(shù)量和物種進(jìn)化水平相關(guān)，數(shù)量越多表明進(jìn)化時(shí)間較長(zhǎng)或變異頻率較高，相反則表明其變異水平越低[20]。本研究表明，白三葉轉(zhuǎn)錄組中平均每5.29 kb 中出現(xiàn)一個(gè)SSR 位點(diǎn)，其頻率高于高加索三葉草(T.ambiguum)[21]、雜花苜蓿(Medicago varia)[22]，低于矩鐮莢苜蓿(M.archiducis-nicolai)[23]，這種差異可能和物種之間SSR 位點(diǎn)的表達(dá)差異有關(guān)[24]。通常認(rèn)為物種中的高級(jí)重復(fù)基元即四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)越多，其變異水平越低，低級(jí)重復(fù)基元即單堿基、二堿基、三堿基重復(fù)越多，其進(jìn)化時(shí)間較長(zhǎng)或變異頻率較高[25]。白三葉轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)主要為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，由此可見(jiàn)，白三葉具有較長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間和較高的進(jìn)化頻率。

SSR 位點(diǎn)長(zhǎng)度與多態(tài)性相關(guān)，SSR 位點(diǎn)長(zhǎng)度≥ 20 bp 時(shí)具有較高的多態(tài)性，12～19 bp 時(shí)多態(tài)性中等， <12 bp 時(shí)多態(tài)性極低[17]。本研究中，白三葉轉(zhuǎn)錄組SSR 位 點(diǎn) 長(zhǎng) 度≥ 20 bp 的 有7 343 處，占 總 數(shù) 的29.42%，說(shuō)明白三葉SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性水平較高。分子標(biāo)記的多態(tài)性是判斷其可用性的重要依據(jù)，數(shù)量豐富、多態(tài)性潛能高的低級(jí)SSR 重復(fù)基序是高效開(kāi)發(fā)白三葉良好的前提，本研究中的白三葉SSR 多態(tài)性較好，是后續(xù)分子標(biāo)記的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究中，根據(jù)白三葉轉(zhuǎn)錄組SSR 設(shè)計(jì)出的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物最多的為三堿基重復(fù)，其次是二堿基重復(fù)，這說(shuō)明進(jìn)化時(shí)間較長(zhǎng)、多態(tài)性較高的SSR 更有可能被用來(lái)作為特異性引物。品種或種質(zhì)資源的特異性是新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[25]。利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建品種指紋圖譜，可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行品種(系)的鑒定，同時(shí)具有很強(qiáng)的個(gè)體特異性，為作物育種和種子管理工作提供了極大的便利[26]。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)作為比較理想的分子標(biāo)記技術(shù)之一[27]，已被廣泛應(yīng)用于豆科牧草如苜蓿[28]、紅三葉(T.pratense)[29]、紅豆草(Onobrychis viciifolia) [30]等多個(gè)物種的品種鑒定。本研究篩選出具有較高多態(tài)性的SSR 引物，對(duì)20 份白三葉品種構(gòu)建DNA 指紋圖譜。DNA 指紋圖譜的構(gòu)建對(duì)白三葉種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育及鑒定均具有積極作用，也可為新品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)與有效利用提供保障。馬驄毓等[30]利用6 對(duì)引物為13 個(gè)白三葉品種構(gòu)建了指紋圖譜，經(jīng)過(guò)比較分析，與本研究所利用的白三葉品種和引物均不相同。就本研究而言，隨著白三葉國(guó)外品種的不斷引進(jìn)且篩選的引物數(shù)量有限，特征條帶也可能在其他品種中出現(xiàn)，因此目前的引物組合僅在一定的材料范圍內(nèi)適用。

4 結(jié)論

白三葉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)分布頻率較高，分布密度大，重復(fù)基元種類(lèi)豐富，具有較高的特異性和多態(tài)性?；诎兹~轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)批量設(shè)計(jì)并篩選多態(tài)性引物是可行的。本研究將為白三葉多態(tài)性及特異性引物的開(kāi)發(fā)、遺傳多樣性評(píng)價(jià)及分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究提供理論依據(jù)。