王貴軍 于天宇 鄧蓓蓓

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1普外科,遼寧 錦州 121000;2采血室)

胃癌是全球第五大惡性腫瘤,其死亡率在所有癌癥排名中居第三位〔1〕。盡管臨床診療策略有所改善,但由于腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高,預(yù)后較差,胃癌患者總生存期并未得到明顯改善。探索胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制,識(shí)別有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),對(duì)提高胃癌患者生存率至關(guān)重要。非編碼RNA(ncRNA)表達(dá)異常與胃癌進(jìn)展關(guān)系密切,環(huán)狀RNA(circRNA)可與靶微小RNA(miRNA)結(jié)合,拮抗miRNA對(duì)其下游靶基因的抑制作用,從而調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等惡性表型〔2,3〕。hsa_circ_0000069表達(dá)增加與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征相關(guān),敲低hsa_circ_0000069可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞周期進(jìn)展和體外增殖、遷移能力〔4〕。hsa_circ_0000069高表達(dá)預(yù)示宮頸癌患者預(yù)后較差,下調(diào)hsa_circ_0000069表達(dá)對(duì)宮頸癌進(jìn)展具有抑制作用〔5〕。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-548c-3p是hsa_circ_0000069的潛在靶點(diǎn)。miR-548c-3p已被報(bào)道參與多種腫瘤過(guò)程,miR-548c-3p通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡來(lái)改善乳腺癌進(jìn)展〔6〕。miR-548c-3p還介導(dǎo)下調(diào)hsa_circ_0101145對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)抑制作用〔7〕。然而,hsa_circ_0000069和miR-548c-3p在胃癌中的表達(dá)和作用并不清楚。本研究首先分析了胃癌中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達(dá)水平,并從細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡角度探討hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1胃癌組織 收集2018年3月至2019年10月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診并接受手術(shù)治療49例,胃癌患者的癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織,其中男31例,女18例,年齡32～75歲,平均(57±5.65)歲,所有標(biāo)本立即置于液氮中冷凍,后在-80 ℃保存直至RNA提取。所有參與者同意使用其組織樣本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞和試劑 人胃癌細(xì)胞系SNU-1、AGS、HS-746T和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);Trizol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司;SYBR Green熒光定量染料法試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司;si-hsa_circ_0000069、pcDNA-hsa_circ_0000069、miR-548c-3p mimics、anti-miR-548c-3p及各組的陰性對(duì)照(si-NC、pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自上海索寶生物科技公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海愛必信生物公司;兔源剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3單克隆抗體(AC033)、兔源β-actin單克隆抗體(AF5003)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) SNU-1、AGS、HS-746T、GES-1細(xì)胞均接種添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含5%CO2溫箱孵育。細(xì)胞80%融合時(shí),胰酶消化后1∶3傳代。

1.4RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表達(dá) 采用TRIzol試劑從采集的49對(duì)組織樣本和細(xì)胞中提取總RNA,測(cè)定濃度和純度后,用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再用SYBR Green法進(jìn)行RT-qPCR。引物序列:hsa_circ_0000069上游5′-CTACTTCAGGCACAGGTCTTC-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;β-actin上游5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′,下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′;miR-548c-3p上游5′-ACACTCCAGCTGGGCAAAAATCTCAAT-3′,下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CG AATTTGCGT-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表達(dá)量。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)期SNU-1細(xì)胞接種24孔板,在細(xì)胞50%融合時(shí)用Lipofectamine2000將siRNA、miRNA mimics、anti-miRNA、pcDNA等轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0000069或miR-548c-3p水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸或質(zhì)粒不同,共分為si-NC組、si-hsa_circ_0000069組、miR-NC組、miR-548c-3p組、pcDNA-hsa_circ_0000069組、pcDNA組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組。未轉(zhuǎn)染的SNU-1細(xì)胞記為對(duì)照(NC)組。

1.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細(xì)胞接種96孔板,貼壁后在每孔中加入10 μl CCK-8試劑,并進(jìn)一步孵育細(xì)胞2 h。用分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)量吸光度(A)以表示細(xì)胞活力。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期分布 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細(xì)胞兩次,800 r/min離心5 min,棄上清,加490 μl預(yù)冷結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶于細(xì)胞懸液中,輕輕混勻。將試管置于冰上,避光孵育10 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細(xì)胞,800 r/min離心5 min,棄上清收集細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷PBS洗滌兩次,加入預(yù)冷75%乙醇在4 ℃固定5 h。1 500 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗滌細(xì)胞后,加入400 μl碘化丙啶和100 μl RNase A于4 ℃避光孵育30 min。用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析結(jié)果。

1.8Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細(xì)胞總蛋白,用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂乳阻斷后,用Cleaved-caspase-3、β-actin一抗在4 ℃孵育膜過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌后,將酶標(biāo)二抗稀釋,室溫孵育膜1 h?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色,Image Lab軟件對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 合成與含有miR-548c-3p預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的hsa_circ_0000069野生(WT)序列或具有預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的突變(MUT)序列,并將其克隆到pGL3載體中獲得重組載體hsa_circ_0000069-WT、hsa_circ_0000069-MUT。用Lipofectamine2000試劑將miR-548c-3p mimics、miR-NC分別與hsa_circ_0000069-WT或hsa_circ_0000069-MUT共轉(zhuǎn)染。48 h后裂解細(xì)胞,測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每次檢測(cè)設(shè)置3個(gè)重復(fù),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)確定兩組數(shù)據(jù)差異,采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)分析多組數(shù)據(jù)差異。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達(dá)情況 胃癌組織中hsa_circ_0000069表達(dá)水平(2.51±0.23)顯著高于癌旁組織(1.00±0.14;t=39.256,P<0.05),miR-548c-3p表達(dá)水平(0.43±0.06)顯著低于癌旁組織(1.00±0.16;t=23.350,P<0.05)。

2.2胃癌細(xì)胞系中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達(dá)情況 胃癌細(xì)胞SNU-1、AGS、HS-746T中hsa_circ_0000069表達(dá)水平(2.34±0.20,2.07±0.19,1.93±0.15)顯著高于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1(1.00±0.11;F=110.190,P<0.05),miR-548c-3p表達(dá)水平(0.41±0.04,0.51±0.05,0.50±0.04)顯著低于GES1細(xì)胞(1.00±0.09;F=186.174,P<0.05)。選擇表達(dá)差異較大的SNU-1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3下調(diào)hsa_circ_0000069抑制SNU-1細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展,誘導(dǎo)凋亡 與NC組比較,si-hsa_circ_0000069組SNU-1細(xì)胞hsa_circ_0000069表達(dá)水平、A值、S期細(xì)胞比例顯著降低,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著升高(均P<0.001),見圖1、表1。

表1 下調(diào)hsa_circ_0000069表達(dá)對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡的影響

1～3:NC組、si-NC組、si-hsa_circ_0000069組圖1 下調(diào)hsa_circ_0000069表達(dá)對(duì)SNU-1細(xì)胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.4上調(diào)miR-548c-3p表達(dá)抑制SNU-1細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展,誘導(dǎo)凋亡 與miR-NC組比較,miR-548c-3p組SNU-1細(xì)胞miR-548c-3p表達(dá)水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著升高,A值、S期細(xì)胞比例顯著降低(均P<0.001),見圖2、表2。

表2 上調(diào)miR-548c-3p表達(dá)對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡的影響

圖2 上調(diào)miR-548c-3p表達(dá)對(duì)SNU-1細(xì)胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5hsa_circ_0000069靶向調(diào)控miR-548c-3p表達(dá) Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)到hsa_circ_0000069序列含有與miR-548c-3p特異性結(jié)合位點(diǎn),見圖3。同與hsa_circ_0000069-WT共轉(zhuǎn)染時(shí),轉(zhuǎn)染miR-548c-3p可降低細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05);同與hsa_circ_0000069-MUT共轉(zhuǎn)染時(shí),轉(zhuǎn)染miR-548c-3p對(duì)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著影響,見表3。si-hsa_circ_0000069組SNU-1細(xì)胞hsa_circ_0000069表達(dá)水平顯著低于si-NC組,miR-548c-3p表達(dá)水平顯著高于si-NC組(P<0.05);pcDNA-hsa_circ_0000069組SNU-1細(xì)胞hsa_circ_0000069表達(dá)水平顯著高于pcDNA組,miR-548c-3p表達(dá)水平顯著低于pcDNA組(P<0.05),見表4。

表3 相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)

表4 RT-qPCR檢測(cè)miR-548c-3p的表達(dá)

圖3 Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)miR-548c-3p和hsa_circ_0000069的靶向關(guān)系

2.6抑制miR-548c-3p表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對(duì)SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影響 與si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組比較,si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組SNU-1細(xì)胞miR-548c-3p表達(dá)水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著降低,A值、S期細(xì)胞比例顯著升高(均P<0.001),見圖4、表5。

表5 抑制miR-548c-3p表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對(duì)SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影響

1～2:si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組圖4 抑制miR-548c-3p表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對(duì)SNU-1細(xì)胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

circRNA是廣泛存在于真核生物細(xì)胞的單鏈RNA,其表達(dá)豐富、性質(zhì)穩(wěn)定,在癌癥進(jìn)展的各個(gè)生物學(xué)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。研究顯示,胃癌中circ_0026344低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、總生存期等顯著相關(guān)〔8〕。胃癌中circ_0008035表達(dá)增加,沉默circ_0008035可抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和鐵死亡〔9〕。circ_0023642、circ_006100等circRNA高表達(dá)可促進(jìn)胃癌腫瘤形成和轉(zhuǎn)移〔10,11〕。然而,circRNA在胃癌中的功能和調(diào)控機(jī)制在很大程度上仍是未知的。本研究結(jié)果提示,hsa_circ_0000069可能參與胃癌進(jìn)展。研究指出,hsa_circ_0000069高表達(dá)與胰腺癌患者較低的總生存率相關(guān),下調(diào)hsa_circ_0000069表達(dá)可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯,抑制其增殖和轉(zhuǎn)移〔12〕。在宮頸癌中hsa_circ_0000069通過(guò)與miR-4426特異性結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移〔13〕。本研究結(jié)果提示,hsa_circ_0000069在胃癌中起著致癌因子作用,下調(diào)hsa_circ_0000069通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制胃癌進(jìn)展。

miR-548c-3p表達(dá)水平是評(píng)價(jià)骨肉瘤良惡性水平的重要參考指標(biāo),上調(diào)miR-548c-3p表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡〔14,15〕。miR-548c-3p通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)的因子(HIF)1α介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路調(diào)控乳頭狀甲狀腺細(xì)胞活力和遷移能力,抑制腫瘤進(jìn)展〔16〕。miR-548c-3p還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移〔17〕。本研究與前人〔17〕報(bào)道的抗腫瘤作用吻合。既往研究顯示,circRNA、lncRNA等ncRNA可與miRNA結(jié)合并抑制miRNA功能,如circ_0001017可抑制致癌因子miR-197表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔18〕;LINC00266-1通過(guò)靶向下調(diào)miR-548c-3p誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔19〕。本研究結(jié)果表明,hsa_circ_0000069通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-548c-3p進(jìn)而參與胃癌進(jìn)展。然而,本研究?jī)H進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),仍需開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌中的作用。