谷偉 馮英慧 楊繼雷

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,河北 張家口 075000)

帕金森病是常發(fā)生于老年人群的一種神經(jīng)退行性疾病,其主要臨床特征為認(rèn)知功能障礙,且已嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量,帕金森病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡等可能引起帕金森病的發(fā)生,1-甲基-4-苯基碘化吡啶(MPP+)可誘導(dǎo)活性氧的形成而促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并可用于建立帕金森病體外細(xì)胞模型〔1〕。目前主要采用藥物治療減緩帕金森病的發(fā)展,因而研發(fā)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的新型藥物具有重要意義,研究表明,部分重要具有抗氧化、抗炎等作用,并可能通過(guò)調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)表達(dá)而清除過(guò)量的氧自由基而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減輕帕金森病細(xì)胞損傷,其中LncRNA在帕金森病中表達(dá)異常,并可能作為藥物治療帕金森病的潛在作用靶點(diǎn)〔2,3〕。近年來(lái),從植物中提取的黃酮具有抗炎、抗氧化等作用,研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧總黃酮是馬齒莧的主要活性成分,且具有抗氧化、抗腫瘤等作用,還可通過(guò)增強(qiáng)海馬組織膽堿能的代謝而改善阿爾茨海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔4〕。目前尚未明確馬齒莧總黃酮在治療帕金森病方面的療效和作用機(jī)制。研究顯示,抑制LncRNA TTTY15表達(dá)的表達(dá)可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔5〕。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)顯示TTTY15與miR-7-5p存在結(jié)合位點(diǎn),研究表明,miR-7-5p在MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可減輕細(xì)胞損傷〔6〕。目前,尚不清楚TTTY15/miR-7-5p是否在馬齒莧總黃酮治療帕金森病的過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究建立帕金森病體外細(xì)胞模型,探討馬齒莧總黃酮是否可通過(guò)調(diào)控TTTY15/miR-7-5p表達(dá)改善帕金森病模型細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 馬齒莧購(gòu)自江西眾創(chuàng)興農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)科技;MPP+購(gòu)自美國(guó)Sigma;人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH購(gòu)自上海信裕生物L(fēng)ipofectamine2000、TTTY15過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-TTTY15)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;si-TTTY15和miR-7-5p mimics及各自陰性對(duì)照物購(gòu)自廣州銳博生物;凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Trizol試劑與miRNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher;反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑購(gòu)自北京天根生化公司;兔抗人酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)3抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)CST。

1.2構(gòu)建帕金森病細(xì)胞損傷模型〔7〕SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)通融合度達(dá)到70%時(shí)加入含有0.2 mmol/L MPP+的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,建立帕金森病細(xì)胞損傷,并記為MPP+組。同時(shí)取正常細(xì)胞記為Con組。

1.3馬齒莧總黃酮提取及實(shí)驗(yàn)處理 取10 kg馬齒莧切碎,分別用70%乙醇提取3次,收集濾液后減壓回收,將浸膏混于水中,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取3次,采用水浴蒸干溶劑,然后采用乙醇、氯仿清洗,加入蒸餾水后經(jīng)水浴加熱溶解,再次采用乙酸乙酯提取,水浴蒸干溶劑,60 ℃干燥處理得到87 g馬齒莧總黃酮(獲得率0.87%)。SK-N-SH細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于6孔板中,使用含10、30、100 μg/ml馬齒莧總黃酮〔8〕并分別含0.2 mmol/L MPP+的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組。采用脂質(zhì)體法分別將si-NC、si-TTTY15轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,然后使用0.2 mmol/L MPP+干預(yù)細(xì)胞24 h,分別記為MPP++si-NC組、MPP++si-TTTY15組。采用脂質(zhì)體法將pcDNA-TTTY15轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,然后使用100 μg/ml馬齒莧總黃酮和0.2 mmol/L MPP+共同干預(yù)細(xì)胞24 h,記為MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組。

1.4噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μl MTT溶液在37 ℃下繼續(xù)孵育4 h,小心棄去上清后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),充分溶解后,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的光密度(OD)值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用不含EDTA的胰蛋白酶對(duì)各組SK-N-SH細(xì)胞進(jìn)行消化,取5×104個(gè)細(xì)胞加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)染液,充分混合后室溫避光孵育15 min,快速使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、SOD的活性與MDA的水平 收集各組SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)上清液,通過(guò)對(duì)應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清LDH、SOD的活性與MDA的水平,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7qRT-PCR檢測(cè)TTTY15、miR-7-5p表達(dá)水平 采用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA,并測(cè)定濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行qRT-PCR,使用PCR儀檢測(cè)TTTY15、miR-7-5p表達(dá)情況,TTTY15以GAPDH為內(nèi)參,miR-7-5p以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TTTY15和miR-7-5p的靶向關(guān)系 將SK-N-SH細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)接種于6孔板,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將野生型質(zhì)粒(wt-TTTY15)、突變型質(zhì)粒(mut-TTTY15)分別與miR-NC、miR-7-5p mimics共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量 各組細(xì)胞提取總蛋白,并測(cè)定蛋白濃度,使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醇胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,將膜用脫脂牛奶封閉60 min,加入相應(yīng)一抗:Cleaved-caspase3、GAPDH,在4 ℃孵育過(guò)夜,隨后加入二抗室溫下孵育90 min,使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色I(xiàn)mageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1馬齒莧總黃酮對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡的影響 與Con組比較,MPP+組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組上述指標(biāo)均顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1、圖2。

圖1 馬齒莧總黃酮抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡的影響

1～5:Con組、MPP+組、MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組圖2 各組Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表1 馬齒莧總黃酮抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡和氧化應(yīng)激

2.2馬齒莧總黃酮對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較,MPP+組LDH活性和MDA水平顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組LDH活性和MDA水平顯著降低,SOD活性顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3馬齒莧總黃酮對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH中TTTY15和miR-7-5p表達(dá)的影響 與Con組比較,MPP+組TTTY15表達(dá)量顯著升高,miR-7-5p的表達(dá)量降低(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組TTTY15表達(dá)量顯著降低,miR-7-5p表達(dá)量顯著升高,且呈劑量依賴性,見(jiàn)表2。

表2 馬齒莧總黃酮對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH中TTTY15和miR-7-5p表達(dá)的檢測(cè)

2.4抑制TTTY15對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡氧化應(yīng)激的影響 與MPP+組、MPP++si-NC組比較,MPP++si-TTTY15組miR-7-5p表達(dá)量明顯升高,細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)均顯著降低,LDH活性和MDA水平顯著降低,SOD活性顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表3、圖3。

1～3:MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-TTTY15組圖3 抑制TTTY15對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡的影響

表3 抑制TTTY15抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡及氧化應(yīng)激

2.5過(guò)表達(dá)TTTY15可逆轉(zhuǎn)馬齒莧總黃酮處理的MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH凋亡氧化應(yīng)激的作用 與MPP++馬齒莧總黃酮組比較,MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組miR-7-5p表達(dá)量顯著降低,細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高,LDH活性、MDA水平均顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖4、表4。

1～3:MPP+組、MPP++馬齒莧總黃酮組、MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組圖4 過(guò)表達(dá)TTTY15可逆轉(zhuǎn)馬齒莧總黃酮對(duì)SK-N-SH凋亡的影響

表4 過(guò)表達(dá)TTTY15可逆轉(zhuǎn)馬齒莧總黃酮對(duì)SK-N-SH凋亡氧化應(yīng)激的作用

2.6TTTY15和miR-7-5p靶向關(guān)系的驗(yàn)證 starbase預(yù)測(cè)顯示TTTY15與miR-7-5p存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖5。與miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染野生型wt-TTTY15和miR-7-5p細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05),見(jiàn)表5。

圖5 TTTY15和miR-7-5p互補(bǔ)序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討 論

目前認(rèn)為減輕神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和異常凋亡損傷可能是減緩帕金森病建站的重要因素,研究發(fā)現(xiàn),中藥具有治療效果好、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn),闡明中藥對(duì)帕金森病的影響及其可能作用機(jī)制對(duì)中藥廣泛用于帕金森病的預(yù)防及治療具有重要意義〔9,10〕。已有研究表明,LncRNA在MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中表達(dá)異常,部分藥物可通過(guò)調(diào)控LncRNA的表達(dá)而減緩帕金森病的發(fā)展進(jìn)程〔11〕。

馬齒莧具有較強(qiáng)的抗氧化作用且具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,研究表明,馬齒莧總黃酮可通過(guò)增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化能力從而減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔12〕。馬齒莧總黃酮可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡從而減輕心肌缺血再灌注損傷〔13〕。馬齒莧總黃酮可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷〔14〕。本研究結(jié)果顯示,MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高,與Zhou等〔15〕研究結(jié)果一致,提示細(xì)胞損傷模型建立成功。本研究提示,馬齒莧總黃酮可促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞增殖并能抑制細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重神經(jīng)細(xì)胞損傷,本研究提示,其可通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)而抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而減緩帕金森病的發(fā)展進(jìn)程。

LncRNA在MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)異常,但其是否可作用馬齒莧總黃酮治療帕金森病的潛在靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探究,本研究提示,減輕MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷可能與抑制TTTY15的表達(dá),促進(jìn)miR-7-5p的表達(dá)有關(guān)。研究表明,敲低TTTY15可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-374a-5p/FOXO1表達(dá)而減輕心肌缺血/再灌注損傷〔16,17〕。TTTY15缺失可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減輕缺氧引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔18〕。本研究提示,TTTY15可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-7-5p表達(dá)而加重MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。已有研究顯示,miR-7-5p表達(dá)在心肌缺血再灌注損傷中被下調(diào),上調(diào)其表達(dá)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖而抑制凋亡率減輕心肌細(xì)胞損傷〔19〕。本研究提示,馬齒莧總黃酮可通過(guò)抑制TTTY15的表達(dá)而促進(jìn)miR-7-5p的表達(dá)從而減輕MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。