王培 何元 侯蕾娜

(陜西省腫瘤醫(yī)院麻醉科,陜西 西安 710061)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是指在患者在麻醉蘇醒的一段時(shí)間內(nèi),輕者表現(xiàn)為記憶損害或健忘綜合征〔1〕,對指令反應(yīng)變遲緩,嚴(yán)重者會(huì)喪失判斷能力和語言概括能力,甚至導(dǎo)致人格改變,患者記憶力、注意力、理解力受損,給患者和家人帶來極大的不良影響〔2〕。若POCD持續(xù)時(shí)間過長,可能會(huì)導(dǎo)致患者社會(huì)活動(dòng)、生活能力降低甚至喪失〔3〕。異氟烷是常用的新型全身吸入麻醉藥,誘導(dǎo)期較短,常用于小手術(shù)或者復(fù)合麻醉,極易引起麻醉過深,雖然在使用過程中給患者和醫(yī)務(wù)人員帶來很多便利,但難免會(huì)導(dǎo)致POCD出現(xiàn)〔4〕。過往研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉提取物對大腦、心臟和血腦屏障等組織器官具有保護(hù)作用〔5〕。未有研究直接證明銀杏葉提取物對POCD有改善作用,本實(shí)驗(yàn)旨在研究銀杏葉提取物對異氟烷麻醉下的大鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取40只8月齡SPF級Wistar大鼠,體質(zhì)量206～232 g,購置來源:杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)2022-0003,所有大鼠在無菌、相對濕度50%、室溫24 ℃的恒溫箱中進(jìn)行喂養(yǎng),飲用水為超純水、所食用食物均經(jīng)過高溫消殺,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2分組與給藥 分組與建模:適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,選取大鼠40只,按照隨機(jī)分法,10只作為空白組,以朱霞等〔6〕大鼠模型為參照,其余30只大鼠均注射6%異氟烷(魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn);國藥準(zhǔn)字H20020267)進(jìn)行麻醉處理,麻醉3.5 h,根據(jù)情況適當(dāng)追加麻醉。造模成功后,將30只大鼠分為建模組、抵抗組、治療組,各10只。給藥:治療組給予20 mg/kg銀杏葉提取物和100 mg/kg生理鹽水腹腔注射,抵抗組注射50 mg/kg銀杏葉提取物和100 mg/kg生理鹽水,空白組和建模組注射50 mg/kg二甲基亞砜和100 mg/kg生理鹽水,給藥48 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3逃逸潛伏期和記憶時(shí)間 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):對各組進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練,使用直徑110 cm,高45 cm的水池,于第三象限設(shè)置一個(gè)直徑10 cm的平臺(tái),隱于水下。將大鼠在象限中央放入大鼠,訓(xùn)練大鼠尋找第三象限平臺(tái),進(jìn)行相關(guān)訓(xùn)練。定位航行訓(xùn)練:4組大鼠連續(xù)訓(xùn)練7 d,訓(xùn)練時(shí),將大鼠從池壁4個(gè)位點(diǎn)放入水中(水溫保持恒定24 ℃),訓(xùn)練大鼠找到隱藏第三象限的水下隱蔽平臺(tái),大鼠能夠找到并在平臺(tái)站立的時(shí)間為逃避潛伏期。每只大鼠每天從4個(gè)入水點(diǎn)分別訓(xùn)練1次,持續(xù)4 d,每次間隔時(shí)間為1 min。從第5天開始視為大鼠完成訓(xùn)練,持續(xù)進(jìn)行強(qiáng)化訓(xùn)練,直至7 d完成。每組選取5只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4曠場實(shí)驗(yàn)分析 分別于麻醉后1 d和2 d同時(shí)間進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)分析,使用120 cm×120 cm×50 cm的黑色無蓋聚乙烯塑料箱,平均分為9格。每次放入一只大鼠于中央箱格內(nèi),自由探索10 min。

采用自動(dòng)圖像監(jiān)視系統(tǒng)自動(dòng)追蹤和記錄大鼠運(yùn)動(dòng)路程,并記錄大鼠行為和在中央格停留時(shí)間。每只大鼠檢測完成后,場地均進(jìn)行消殺和痕跡去除。

1.5大鼠海馬組織病理形態(tài)觀察 進(jìn)行行為實(shí)驗(yàn)后,每組隨機(jī)抽取一只大鼠,予以麻醉處理,斷頭、去除顱骨,取出腦組織,于低溫快速剝離海馬組織,將海馬組織置于3%戊二醛固定液中低溫冷藏備用。于低溫快速剝離海馬組織,將低溫處理的海馬組織研磨均勻,1 500 r/min處理3 min。將冷藏的海馬組織使用70%丙酮處理15 min后,再次使用90%丙酮做二次處理,重復(fù)兩次上述步驟;將脫水處理后的海馬組織聚合固化為包埋塊,經(jīng)后續(xù)處理后,使用超薄切片機(jī)切割出40 nm的切片,放置于載網(wǎng),使用滴染液(醋酸鈾、硝酸鉛)染色10 min。將處理后的海馬組織切片用透射電鏡觀察,拍攝海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.6海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒處理,將上文所得海馬組織溶液稀釋,放入孵育箱37 ℃溫育30 min,使用顯色劑處理,450 nm波長觀察吸光值,檢驗(yàn)溶液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。

1.7Western印跡法檢相關(guān)蛋白 取大鼠海馬組織研碎之后,加入300 μl裂解液,混合均勻,低溫靜止1 h,以3 500 r/min離心10 min后,收集上層清液。將獲得的溶液采用二喹啉甲酸(BCA)檢測法,加熱使蛋白質(zhì)變形,再次離心10 min,取上層清液待檢。每孔上樣分離膠與濃縮膠60 μl,100 V恒壓電泳2 h,待溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部時(shí),停止操作。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)印膜,TBST洗3次,2 min/次。加入核磷蛋白(c-FOS)、血清蛋白(SP)孵育。使用辣根過氧化物酶耦聯(lián)二級抗體山羊抗兔IgG室溫再次孵育,將其放入電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液中,使其顯色,成像系統(tǒng)對光密度進(jìn)行分析B淋巴細(xì)胞-2基因相關(guān)X蛋白(Bax)的蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、重復(fù)測量的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1逃逸潛伏期和記憶時(shí)間 如表1所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組第4、5、7天潛伏逃逸時(shí)間變長、記憶時(shí)間縮短,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,抵抗組、治療組第4、5、7天潛伏逃逸時(shí)間較短,記憶時(shí)間較長,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與治療組相比,抵抗組第4、5、7天潛伏逃逸時(shí)間較短,記憶時(shí)間較長,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組逃逸潛伏期和記憶時(shí)間

2.2曠場實(shí)驗(yàn) 如表2所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組第1、7天停留時(shí)間變長、站立次數(shù)和跨格次數(shù)減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,抵抗組、治療組第1、7天停留時(shí)間較短、站立次數(shù)和跨格次數(shù)較多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與治療組對比,抵抗組第1、7天停留時(shí)間較短、站立次數(shù)和跨格次數(shù)較多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組曠場實(shí)驗(yàn)比較

2.3大鼠海馬組織病理形態(tài)觀察 如圖1所示,空白組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整,排列整齊,細(xì)胞呈極性排列分布;模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)分散,數(shù)量減少,排列紊亂無序,大部分細(xì)胞皺縮,部分細(xì)胞核固縮,細(xì)胞染色質(zhì)異常;相比較模型組,抵抗組和治療組CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為清晰,細(xì)胞排列整齊,少部分染色質(zhì)異常,小部分細(xì)胞核固縮;相比較治療組,抵抗組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)更清晰緊湊,排列更清晰,染色質(zhì)變異較少。

圖1 各組海馬組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.4海馬組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 如表3所示,與空白組對比,模型組、抵抗組、治療組GSH-Px、SOD、GSH表達(dá)降低,MDA表達(dá)上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,抵抗組、治療組GSH-Px、SOD、GSH表達(dá)升高,MDA表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與治療組對比,抵抗組GSH-Px、SOD、GSH表達(dá)較高,MDA表達(dá)較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)及海馬組織Keap1、Nrf2、ARE mRNA相對表達(dá)水平比較

2.5Western印跡法檢測Keap1、Nrf2、ARE、Bax蛋白表達(dá)情況 如表3、圖2所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組腦組織Keap1、Bax、ARE表達(dá)升高,Nrf2表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,抵抗組、治療組Keap1、Bax、ARE表達(dá)降低,Nrf2升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與治療組相比,抵抗組Keap1、Bax、ARE表達(dá)升高、Nrf2表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測Keap1、Nrf2、ARE、Bax 蛋白表達(dá)

3 討 論

吸入性麻醉是指揮發(fā)性麻醉藥物經(jīng)過呼吸道,以氣體的方式吸入肺內(nèi),由肺泡進(jìn)入血液循環(huán)而達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng),抑制中樞神經(jīng)從而暫時(shí)使機(jī)體意識(shí)、感覺、反射等部分張力減弱或消失的一種麻醉方法〔7〕。

異氟烷是常用的吸入性麻醉藥,適用于全身麻醉,麻醉效力小于付完和甲氧氟烷〔8〕。由于其麻醉深度容易控制,在臨床常用于小手術(shù)和腦部手術(shù)〔9〕。相關(guān)研究證實(shí)異氟烷作為全麻藥對患者的認(rèn)知行為具有損害作用〔10〕。銀杏葉提取物具有廣泛生物學(xué)效應(yīng),對腦細(xì)胞具有保護(hù)和恢復(fù)作用〔11〕。

水迷宮實(shí)驗(yàn)通過強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳,學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺(tái)的實(shí)驗(yàn),用來測驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對空間位置和空間定位的學(xué)習(xí)能力〔12〕。研究證明,水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠潛伏逃逸時(shí)間說明大鼠學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知能力,大鼠找到水中平臺(tái)和對環(huán)境的感知能力和海馬區(qū)有關(guān)〔13,14〕。大鼠海馬體積變小,導(dǎo)致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙和記憶障礙〔15〕。本研究驗(yàn)證了針對異氟烷所產(chǎn)生的POCD癥狀,銀杏葉提取物可以改善患者不良癥狀,對受傷害的海馬區(qū)保護(hù)和恢復(fù)具有正向效能。曠場實(shí)驗(yàn)是將動(dòng)物放置在一個(gè)封閉的平面區(qū)域中,觀察行為和活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)〔16〕。從動(dòng)物在劃分區(qū)域中活動(dòng)的次數(shù)和軌跡分析動(dòng)物神經(jīng)緊張度〔17〕。相關(guān)研究表明,站立行為反映動(dòng)物對新環(huán)境的適應(yīng)情況和自身的興奮程度〔18〕?？绺翊螖?shù)反映的是對環(huán)境的探索程度〔19〕。中央停留時(shí)間反映大鼠對周圍環(huán)境的認(rèn)知能力〔20〕。本研究說明,銀杏葉提取物對POCD大鼠的認(rèn)知能力和記憶能力有保護(hù)和恢復(fù)效果,且存在較好保護(hù)能力。

認(rèn)知功能障礙的病理進(jìn)程和腦部蛋白的沉積及自由基氧化反應(yīng)有關(guān)〔21〕。氧化應(yīng)激狀態(tài)下,海馬組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙〔22〕。研究表明,GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶〔23〕。GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽,具有抗氧化作用〔24〕。SOD又稱超氧歧化酶,MDA是過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,機(jī)體內(nèi)丙二醛上升則表示機(jī)體過氧化反應(yīng)劇烈〔25〕。本研究說明,銀杏葉提取物有助于降低機(jī)體內(nèi)過氧化反應(yīng),對POCD預(yù)防和治療有較好效果。

Keap1-Nrf2/ARE分為兩部分,一部分在細(xì)胞質(zhì),一部分在細(xì)胞核。Nrf2與上游Keap1特異性結(jié)合,Nrf2活性受到抑制,促進(jìn)其激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合。相關(guān)研究表明,Bax可促使細(xì)胞器釋放出某些信號(hào)分子,在這些信號(hào)分子作用下半胱氨酸蛋白酶活化,進(jìn)而拮抗B細(xì)胞淋巴瘤-2的抗凋亡效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡,或者作用于線粒體膜,降低線粒體膜電位,使線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)開放,線粒體膨脹,使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔26〕。Keap1-Nrf2/ARE通路是抗氧化應(yīng)激的核心通路之一,Keap1是重要阻遏蛋白,與Nrf2結(jié)合后存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),Nrf2被激活與Keap1接力,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),與ARE對應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)而提升細(xì)胞抗氧化能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究說明,銀杏葉提取物有效減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),減少海馬組織細(xì)胞萎縮和染色質(zhì)變異,提升大鼠記憶能力和認(rèn)知能力。