陳輝 袁鈺 蔣濤

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院推拿科,安徽 合肥 230061)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由脂質(zhì)堆積于動(dòng)脈內(nèi)膜而引起的慢性炎癥反應(yīng)性疾病,主要發(fā)生在人體的大中動(dòng)脈內(nèi)〔1〕。此病的早期癥狀并不明顯,而當(dāng)病理改變引起動(dòng)脈狹窄至一定程度后,可引起持續(xù)的缺血癥狀。人體的腦組織需氧量較高且新陳代謝較快,主要依靠腦內(nèi)動(dòng)脈攝取能量〔2〕。頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和椎動(dòng)脈(VA)是腦內(nèi)的主要供血?jiǎng)用}。其中ICA上行入顱內(nèi)后分為大腦前動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈,主要負(fù)責(zé)腦前部的血液供給。因此,AS及其硬化斑塊引起動(dòng)脈狹窄是引起腦梗死等缺血性腦血管疾病的關(guān)鍵因素。同時(shí),若斑塊在外因作用下脫落、破裂,可形成栓子繼而引起心血管栓塞等嚴(yán)重不良事件〔3〕。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,老年人脾腎虧虛,精血不足,因而經(jīng)脈失濡養(yǎng),陽氣衰微而無力化濕,濕邪積于體內(nèi)而化熱,內(nèi)邪阻滯經(jīng)絡(luò)而致經(jīng)絡(luò)不同,形成此證。隨著老齡化加劇及高脂血癥、糖尿病等基礎(chǔ)病的發(fā)病率逐年升高,AS的發(fā)病率也逐年增加。

推拿療法是基于中醫(yī)學(xué)理論,運(yùn)用特定手法作用于特定部位或穴位,以達(dá)到治療或預(yù)防疾病目的的療法,其中頸椎旋轉(zhuǎn)療法是一種臨床中常用的脊柱推拿療法,通過旋轉(zhuǎn)頸椎、推動(dòng)棘突等操作以達(dá)到松解頸部關(guān)節(jié)和肌肉、進(jìn)而緩解疼痛等治療目的〔4,5〕。但頸椎的生理結(jié)構(gòu)較為薄弱,更易發(fā)生損傷,部分患者經(jīng)治療后會出現(xiàn)一過性低血壓、眩暈等不良反應(yīng),因此頸椎旋轉(zhuǎn)治療的安全性,也是近年?duì)幷摰慕裹c(diǎn)。臨床中部分經(jīng)頸椎旋轉(zhuǎn)手法治療后出現(xiàn)不適的患者多數(shù)都存在AS,如何安全地對AS患者進(jìn)行頸椎旋轉(zhuǎn)手法治療及頸椎旋轉(zhuǎn)手法是否會引起血流動(dòng)力學(xué)改變及其他不良反應(yīng),是本研究的重點(diǎn)。

隨著影像學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,可實(shí)現(xiàn)對AS斑塊進(jìn)行載體動(dòng)態(tài)觀測〔6〕。本研究擬通過構(gòu)建家兔頸動(dòng)脈斑塊形成模型,觀察頸椎旋轉(zhuǎn)手法對其血流剪切力、相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的影響,為優(yōu)化臨床中頸椎旋轉(zhuǎn)手法治療方案、提升其安全性積累基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取成年雄性3月齡新西蘭兔40只,體質(zhì)量2 000～2 500 g,由湖南太平生物科技有限公司提供。許可證號:SCXK(湘)2020-0005。家兔均單籠飼養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。環(huán)境溫度為(23±1)℃,濕度<70%,環(huán)境噪聲小于60 dB,12 h光暗周期。每2 w對飼養(yǎng)籠進(jìn)行清洗。飼養(yǎng)方法依據(jù)各組實(shí)驗(yàn)方案,自由飲水。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 小動(dòng)物彩超(IU22,飛利浦電子),脫水機(jī)(JT-12J,武漢俊杰電子),病理切片機(jī)(RM2016,上海萊卡儀器),包埋機(jī)(JB-L5,武漢駿杰電子),光學(xué)顯微鏡(NIKON ELIPSE CI,上海普赫光電科技);球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(愛德華生命科學(xué)),磷酸鹽緩沖液(PBS)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑,生理鹽水、戊巴比妥鈉溶液、碘伏消毒液、青霉素注射液、無菌紗布、無菌手術(shù)單、可吸收縫合線(江蘇豪森藥業(yè)),兔白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒、兔IL-1β試劑盒、Masson染色試劑盒(Solarbio)高脂飼料(金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型及分組 將40只家兔依照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(5只)、模型組(5只)及實(shí)驗(yàn)組(30只),實(shí)驗(yàn)組又分為頸椎旋轉(zhuǎn)90 °組(A組,10只),頸椎旋轉(zhuǎn)105 °組(B組,10只),頸椎旋轉(zhuǎn)120 °組(C組,10只)。選用ICA內(nèi)皮拉傷聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建ICA斑塊形成動(dòng)物模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)后,除對照組以外,家兔均進(jìn)行造模,術(shù)前12 h禁食,使用3%戊巴比妥鈉溶液,依照22.5 mg/kg劑量對家兔進(jìn)行麻醉。麻醉后將家兔固定于手術(shù)臺,將左側(cè)頸總動(dòng)脈區(qū)域消毒并剃毛,沿著頸總動(dòng)脈走行切開皮膚,將頸內(nèi)外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈剝離,使用血管鉗于頸總動(dòng)脈分叉上方1.5 cm處的頸內(nèi)外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈分叉處下方3 cm結(jié)扎,于頸外動(dòng)脈結(jié)扎處下方0.5 cm剪一小口,將球囊經(jīng)此插入ICA,使用注射器向內(nèi)注射空氣使球囊擴(kuò)張,抽插3次后將球囊抽出,隨后于切口下方結(jié)扎動(dòng)脈,解除血管鉗后密切觀察,無出血情況即可縫合皮膚,注射80萬U青霉素防止感染,每日1次,共3次。對照組家兔正常喂養(yǎng)(120 g/d),其余家兔采用高脂飲食喂養(yǎng)(92%普通飼料+2%膽固醇+5%豬油+1%蛋黃粉,120 g/d),連續(xù)飼養(yǎng)8 w。

1.3.2動(dòng)物模型檢測 實(shí)驗(yàn)組家兔飼養(yǎng)8 w后,選用頸動(dòng)脈彩超檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠裰苽涑晒Α⒓彝寐樽砗蠊潭檠雠P位,充分暴露頸部并消毒剃毛,使用動(dòng)物彩超機(jī)將探頭與頸總動(dòng)脈呈30 °夾角,從氣管內(nèi)側(cè)縱起掃描至頸總動(dòng)脈分叉處及ICA,沿ICA走行向頭側(cè)移動(dòng),隨后將探頭轉(zhuǎn)動(dòng)90 °后沿血管走行掃描縱切面和橫截面,觀察記錄左側(cè)ICA內(nèi)膜厚度及斑塊形成情況。若斑塊形成且管腔狹窄程度≥70%,則模型制備成功〔7〕。

1.3.3頸椎旋轉(zhuǎn)手法干預(yù) 剔除模型制備失敗的家兔,實(shí)驗(yàn)組家兔進(jìn)行頸椎旋轉(zhuǎn)手法治療。參考人體頸部推拿操作方法:將家兔置于蹲坐位,安撫至安靜后,以滾法、彈撥法、一指禪法放松頸部肌肉,隨后將其頸部前屈約15 °,拇指和食指置于頭頸部,掌心置于后頸處,另一手托住下頜,雙手向上牽拉并反向旋轉(zhuǎn),角度依次為90、105、120 °,每周治療3次,連續(xù)治療2 w。

1.3.4實(shí)驗(yàn)指標(biāo) (1)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測:手法治療結(jié)束后,取各組家兔耳緣靜脈血,倒置振蕩5 min后,于2 h內(nèi)檢測血液黏滯度(η),同時(shí)計(jì)算血流剪切力(τm),τm=血液黏滯度×4×平均血流速度/左頸總動(dòng)脈血管舒張末期管腔直徑。(2)血清細(xì)胞因子水平檢測:血清收集方法同上。選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測樣本中IL-6、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1水平。選用兔IL-6、IL-1β、MCP-1試劑盒進(jìn)行檢測,嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3)頸總動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察:干預(yù)結(jié)束后,以空氣栓塞法將各組家兔處死,取左側(cè)頸總動(dòng)脈,室溫下以PBS沖洗干凈并剝離脂肪和筋膜,4%甲醛溶液固定后,脫水,透明,石蠟包埋后切片,將一半的切片進(jìn)行Masson染色。嚴(yán)格依照Solarbio試劑盒操作說明進(jìn)行染色操作制作切片。每個(gè)切片選出3個(gè)視野進(jìn)行拍照,使用Image-Pro Plus軟件計(jì)算視野中的纖維帽厚度/脂質(zhì)核比值。(4)頸總動(dòng)脈黏附因子水平比較:選用免疫組化法檢測各組家兔頸總動(dòng)脈血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1水平。將石蠟切片使用3%過氧化氫溶液除去過氧化物酶,滴加非免疫動(dòng)物血清后靜置20 min,加入一抗后,PBS沖洗,隨后加入二抗,沖洗后加入ABC復(fù)合物,隨后進(jìn)行DAB顯色,在鏡下觀察后,使用MIAS圖像系統(tǒng)進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)染色陽性細(xì)胞在視野內(nèi)的比例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1造模結(jié)果 造模后,共有6只造模失敗,其中模型組1只、A組2只、B組1只、C組2只,其余均造模成功。頸動(dòng)脈彩超可見左側(cè)ICA的管腔狹窄,管壁普遍增厚,可見強(qiáng)回聲。對照組家兔左側(cè)ICA經(jīng)超聲檢查后,示動(dòng)脈管未見管腔狹窄或斑塊,血管壁厚度均一。

2.2血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 造模后各組血液黏滯度顯著升高,而血流剪切力顯著下降(P<0.05),治療后,A、B、C組血液黏滯度和血流剪切力均明顯下降且低于模型組,同時(shí)隨著旋轉(zhuǎn)角度增加,血液黏滯度增加而血流剪切力下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)及血清IL-6、IL-1β、MCP-1水平、Masson染色結(jié)果比較

2.3各組血清IL-6、IL-1β、MCP-1水平比較 制備ICA斑塊模型后,各組的炎性因子水平均顯著升高,A、B、C組IL-6、IL-1β、MCP-1水平明顯低于模型組,同時(shí)經(jīng)治療的A、B、C組家兔的炎性因子水平顯著下降,A組低于B組,B組低于C組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4Masson染色結(jié)果 如圖1所示,Masson染色將肌原纖維染為淡紅色或紅色,細(xì)胞核染為黑藍(lán)色,膠原纖維染為藍(lán)色。各組均可見斑塊的形成,且模型組更為明顯。同時(shí)造模后,各組斑塊膠原含量/斑塊面積比值均顯著下降(P<0.05),A、B、C組比值較模型組顯著增加(P<0.05),且隨頸椎旋轉(zhuǎn)角度增加而顯著升高(P<0.05)。見表1。

圖1 各組左頸總動(dòng)脈(Masson染色,×100)

2.5各組VCAM-1、ICAM-1水平 制備ICA斑塊模型后,各組黏附因子水平均顯著升高(P<0.05),A、B、C組VCAM-1、ICAM-1水平明顯低于模型組,且A組低于B組,B組低于C組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組VCAM-1、ICAM-1水平比較

3 討 論

頸動(dòng)脈血管粥樣硬化是彌漫性血管病理性改變,主要表現(xiàn)為隨年齡增長而加重的炎性反應(yīng)和增生,廣泛發(fā)生于全身的動(dòng)脈中,嚴(yán)重危害老年人群的生命健康。頸椎旋轉(zhuǎn)療法是臨床中常用于頸部治療的手法,可通過旋轉(zhuǎn)頸部關(guān)節(jié)達(dá)到松解肌肉、降低肌張力、緩解疼痛的作用,但其安全性一直是爭議的焦點(diǎn)〔8〕。有學(xué)者指出,在對患者進(jìn)行頸椎旋轉(zhuǎn)治療前需進(jìn)行安全性評估,其中合并頸動(dòng)脈斑塊就是一項(xiàng)關(guān)鍵的危險(xiǎn)因素。

頸動(dòng)脈斑塊模型有大鼠、小鼠、家兔及豬等,家兔由于體型適中,是常用的動(dòng)物模型〔9〕。本研究選用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊拉傷造模法,誘導(dǎo)頸動(dòng)脈發(fā)生粥樣化病變,彩超檢測結(jié)果也驗(yàn)證了模型制備方法的可靠性。

血流剪切力是指血管中血液在血液黏滯度的作用下,對血管內(nèi)壁和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的摩擦力,與動(dòng)脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)〔10〕。有研究表明,持續(xù)的血流剪切力下降可能引起血管內(nèi)皮功能受損,可導(dǎo)致粥樣硬化斑塊形成,同時(shí)影響斑塊的分布〔11〕。本研究結(jié)果提示,斑塊形成后的血流動(dòng)力學(xué)病理性改變,頸椎旋轉(zhuǎn)手法能夠有效改善頸動(dòng)脈斑塊形成,頸椎旋轉(zhuǎn)手法角度過大可能減弱手法治療效果,引起斑塊的穩(wěn)定性降低。

IL-1β由內(nèi)皮細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,可通過增加血管通透性、刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等途徑,進(jìn)而加劇血管內(nèi)膜增生、血管壁受損,促進(jìn)血栓的形成〔12〕。IL-6是常用的炎性標(biāo)記物,可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)血小板源性生長因子的水平進(jìn)而加速斑塊的形成,同時(shí)也可反映機(jī)體的炎性水平,MCP-1是一種趨化因子,參與單核細(xì)胞與炎性細(xì)胞的活化和遷移,通過加強(qiáng)細(xì)胞間黏附,使單核細(xì)胞聚集于血管受損處,侵入內(nèi)皮后分化為巨噬細(xì)胞,進(jìn)一步AS的發(fā)生和發(fā)展〔13,14〕。本研究結(jié)果提示,頸椎旋轉(zhuǎn)手法能夠有效通過下調(diào)炎性反應(yīng)水平進(jìn)而發(fā)揮治療作用,頸椎旋轉(zhuǎn)手法角度過大可能降低手法的治療效果,促進(jìn)斑塊形成后家兔頸動(dòng)脈處的炎性反應(yīng)和血管壁受損,進(jìn)而促進(jìn)斑塊的形成。

AS斑塊由纖維帽斑塊和脂質(zhì)核心構(gòu)成,纖維帽厚度與脂質(zhì)核心的面積影響著斑塊的穩(wěn)定性。研究表明,隨著脂質(zhì)核心面積的增加,斑塊穩(wěn)定性下降,更易發(fā)生破裂,極易引起心血管并發(fā)癥〔14,15〕。本研究結(jié)果提示,頸椎旋轉(zhuǎn)手法能夠有效改善斑塊的穩(wěn)定性,頸椎旋轉(zhuǎn)角度過大可能降低斑塊不穩(wěn)定,加速其破裂。

VCAM-1、ICAM-1主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面,屬于免疫球蛋白。在動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化病變的過程中,血管內(nèi)皮受損,黏附因子等活性物質(zhì)會引起內(nèi)核細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附并進(jìn)入內(nèi)皮,吞噬脂質(zhì)最終演變?yōu)榕菽?xì)胞,加速粥樣硬化斑塊的形成〔16〕。內(nèi)皮細(xì)胞在多種因素刺激下表達(dá)活性升高,上調(diào)ICAM-1表達(dá),增加了內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞之間的黏附,加劇炎性反應(yīng),同時(shí)脂質(zhì)過氧化會引起VCAM-1過表達(dá)〔17〕。本研究表明,頸椎旋轉(zhuǎn)角度過大,可能導(dǎo)致血管和細(xì)胞間的黏附上調(diào)進(jìn)而加劇內(nèi)皮的損傷程度,降低治療效果。

同時(shí)本研究也存在一定的不足。首先由于實(shí)驗(yàn)條件的限制,本研究的樣本量較小,研究結(jié)果較為局限,未來可擴(kuò)大樣本量,增強(qiáng)研究結(jié)果的可信度,降低誤差。其次由于解剖結(jié)構(gòu)的差異性,家兔的頸部結(jié)構(gòu)與人體具有較大差異,因此家兔所用推拿治療手法與人體的安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究僅對頸椎旋轉(zhuǎn)手法的角度進(jìn)行了探究,未能對手法作用的力量、速度及治療頻率和治療時(shí)長進(jìn)行對比,同時(shí)由于斑塊形成是長期的病理作用結(jié)果,后續(xù)研究中可考慮增加不同時(shí)間點(diǎn)對照組,以觀察頸椎旋轉(zhuǎn)療法的長期影響。

綜上,頸椎旋轉(zhuǎn)手法可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和黏附因子水平等途徑改善頸動(dòng)脈斑塊,但隨著頸椎旋轉(zhuǎn)角度增加,可能降低手法的治療效果。