宋鵬程 趙衛(wèi)國 王明麗 宋長軍 趙學榮 王宏業(yè) 王響 楊鳳愛 李炳茂

(衡水市人民醫(yī)院中醫(yī)科,河北 衡水 053000)

幽門螺桿菌(Hp)相關胃炎主要是由Hp定植于胃黏膜后引起患者出現(xiàn)胃痛、惡心、口腔異味、胃脹等癥狀。西藥技術主要采用鉍制劑、質(zhì)子泵抑制劑及抗生素聯(lián)用的方法幫助患者清除臟器黏膜中的Hp,但是,該療法療程長,療效不穩(wěn)定,毒副作用如嘔吐、乏力等問題突出〔1〕,因此臨床上急需需要一種安全、高效、不良反應少的藥物來控制疾病的惡化。中醫(yī)藥技術在治療慢性胃炎、Hp感染相關胃炎等消化系統(tǒng)疾病方面具有價格低廉,療效顯著、不易復發(fā)等優(yōu)勢。中醫(yī)臨床醫(yī)師認為〔2〕,Hp為疫毒外邪,不僅影響臟器功能,并可導致機體正氣損傷,氣機失司,血行不暢,脾失運化,胃失和降,氣滯化熱,水蘊成濕,因此脾胃濕熱型是Hp相關胃炎最為常見的分型。因此中醫(yī)臨床醫(yī)師在“健脾益氣,清熱祛濕”的指導下,形成了滅幽湯、芪連溫膽湯、健脾化瘀解毒方等一系列的方劑,用于疾病的臨床治療,顯示了良好的療效〔3〕。黃連胃舒湯主要由黃連、黃芪、元胡、蒲公英、紫蘇、白芍等中藥組成,具有祛濕健脾,理氣升陽等效用。鄭泉〔4〕臨床研究報道將黃連胃舒湯用于Hp相關胃炎的治療,能有效清除Hp,不良反應少,但是未將其中的機制闡明。細胞自噬是一種維系自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的自我保護機制。在疾病的初期,能夠幫助細胞抵抗不良刺激,延緩細胞凋亡,但是過度的自噬可能導致細胞中線粒體腫脹,呈現(xiàn)空泡樣變性,加速細胞的凋亡,影響臟器的結(jié)構(gòu)與功能〔5〕。Wang等〔6〕研究顯示,Hp感染胃黏膜后,激活胃黏膜上皮細胞的自噬,誘導細胞異常凋亡,促進Hp的大面積定植。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是一條重要的內(nèi)源性的自噬相關通路。張高煉等〔7〕研究顯示,激活mTOR的表達能明顯抑制腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)元細胞的自噬,但是該通路在Hp相關胃炎中的作用表達較少。本研究探討黃連胃舒湯對Hp相關胃炎脾胃濕熱型小鼠胃黏膜的保護作用。

1 材料和方法

1.1試驗動物、主要試劑及儀器 雄性,BALB/c小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(19±2)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK(京)2020-0004。在濕度為45%～55%,溫度20～22 ℃,條件下的動物房中進行明暗各12 h交替的適應性喂養(yǎng),實驗動物均自由攝食與進水,單籠飼養(yǎng)。本研究以獲取醫(yī)院動物倫理委員會的審核批準。

黃連胃舒湯中的黃連(100 g)、黃芪(100 g)、元胡(50 g)、蒲公英(100 g)、紫蘇(50 g)、白芍(100 g)均由醫(yī)院的中藥房提供,中藥的抓取及煎煮均有專門藥劑人員負責,并且煎煮好的中藥湯藥放置在專門的冰箱里備用。

mTOR-inhibitor和mTOR-inhibitor-NC均由北京中科基因技術有限公司設計完成。Hp悉尼菌株購自中科院微生物研究所(北京)。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL試劑盒、封閉液、Western印跡試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司),兔抗mTOR和微管相關蛋白1輕鏈3-β(LC3)抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)。

切片機(上海巴玖實業(yè)有限公司),X71光學顯微鏡(日本Olympus公司),低溫冷凍冰箱(青島海爾股份有限公司),Universal Hood Ⅱ凝膠成像處理系統(tǒng)(美國Bio-rad公司),垂直電泳儀(北京六一儀器廠),Philips 201透射電子顯微鏡(荷蘭Eindhoven公司)。

1.2動物模型的復制及分組處理 根據(jù)段繼昌等〔8〕介紹的方法進行脾虛濕熱證型造模:造模動物每日以80%基礎飼料、12%豬油、8%蜂蜜配置的高脂高糖飼料進行喂養(yǎng),并在濕度(70±5)%,溫度(30±3)℃,每日光照時長在12 h內(nèi),進行飼養(yǎng),連續(xù)28 d。觀察小鼠的體質(zhì)量、飲水與攝水,皮毛狀況。當小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振,倦怠嗜臥,皮毛暗淡缺乏光澤度,枯黃脫落,不思飲食,體質(zhì)量增加明顯減緩,大便不成形,時干時稀等表現(xiàn)時,視為造模成功。

根據(jù)張鑫龍等〔9〕介紹的方法進行Hp感染胃炎造模:將Hp菌株濃度調(diào)整為0.5×1010pfu/ml備用。在脾虛濕熱癥型造模14 d時,將小鼠禁食12 h后以Hp菌進行灌胃,每次灌胃0.3 ml,兩次灌胃時長間隔48 h,灌胃結(jié)束4 h后恢復飲食,灌胃3次后,隨機處死兩只小鼠,剝離小鼠的胃竇組織,進行瑞-姬氏染色,觀察Hp定植情況,在光鏡下,可觀察到桿狀的幽藍色Hp分布在胃黏膜上皮細胞表面視為造模成功。

將小鼠隨機分為正常組、模型組、黃連胃舒湯組(藥物組)、mTOR-inhibitor組(抑制劑組),每組10只,其中正常組在造模過程中以正常飼料喂養(yǎng),并以生理鹽水灌胃。經(jīng)評判造模成功后,藥物組小鼠每日以500 mg/kg黃連胃舒湯灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor-NC 1次,抑制劑組小鼠每日以500 mg/kg黃連胃舒湯灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor 1次;正常組和模型組每日等劑量的生理鹽水灌胃2次,并腹腔注射5×109pfu/ml的mTOR-inhibitor-NC 1次,連續(xù)處理14 d。

1.3黃連胃舒湯對小鼠胃排空的影響 在實驗過程中,每日記錄實驗動物的精神狀態(tài)、進食與飲水量,活動量,糞便與皮毛狀況。末次給藥結(jié)束4 h后,以0.8 ml半固體營養(yǎng)糊100 g進行灌胃,15 min后處死小鼠,在無菌操作臺上剖腹,將小鼠的胃賁門、胃幽門結(jié)扎,以濾紙吸干水分,稱胃全重,然后通過手術剪沿胃大彎剖開胃體,洗去胃壁附著物,濾紙吸干水分,稱胃凈重,小鼠的胃排空率(%)=〔1-(胃全重-胃凈重)/半固體營養(yǎng)糊質(zhì)量〕%,同時將小鼠的胃組織封存待測。

1.4黃連胃舒湯對小鼠胃組織中Hp定植的影響 取小鼠的胃組織,常規(guī)固定,石蠟切片,瑞-姬氏染色,經(jīng)脫水、透明后,封片,上鏡觀察,同時隨機選定5個視野進行Hp計數(shù),并根據(jù)平均光密度值統(tǒng)計分析Hp的定植狀況。

1.5黃連胃舒湯對小鼠胃組織組織病理學的影響 取小鼠的胃組織,多聚甲醛固定,石蠟包埋,梯度無水乙醇脫水,制成3～5 μm的切片,HE染色,二甲苯透明,封片,鏡檢。

1.6黃連胃舒湯對小鼠胃組織超微結(jié)構(gòu)影響 取小鼠胃組織,戊二醛固定1 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,鋨酸再固定90 min,脫水,包埋,切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色,Philips 201透射電子顯微鏡下觀察,拍照。

1.7黃連胃舒湯對小鼠胃組織的細胞凋亡的影響 取小鼠的胃組織,常規(guī)固定,梯度無水乙醇脫水,漂洗,20 μg/ml的Tris-HCL蛋白酶K消化,PBS洗滌,TUNEL染色,室溫孵育,清洗后,封片,ImageJ圖像軟件測定TUNEL陽性細胞的比例。

1.8黃連胃舒湯對小鼠胃組織中自噬標志蛋白LC3表達 取小鼠的胃組織,經(jīng)甲醛固定,石蠟切片,脫蠟,梯度乙醇脫水,抗原修復,牛血清白蛋白封閉,依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000),PBS洗滌,蘇木素復染,封片后,顯微鏡下觀察,視野中出現(xiàn)棕黃色顆粒表示目的蛋白表達。

1.9黃連胃舒湯對小鼠胃組織中mTOR和LC3表達水平 取小鼠的胃組織,在4 ℃裂解液中放置30 min,離心,并將上清液稀釋,常規(guī)方法提取樣本中的總蛋白,以50 μg樣品進行上樣,電泳后,轉(zhuǎn)模,封閉,加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀釋后,室溫孵育后,顯色30 min,以GAPDH為參照,分析目標蛋白的灰度值。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素分析,兩兩比較用t檢驗,采用Graphpad8.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1各組實驗過程中的一般狀態(tài)和胃排空率的變化 在實驗過程中,各組未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。正常組精神狀態(tài)良好,每日活動量未見異常,皮毛柔順且有光澤,進食、飲水與大小便未見異常,體質(zhì)量明顯增加;模型組出現(xiàn)精神萎靡不振,皮毛暗淡,稀疏無光澤,疲乏嗜臥,喜歡蜷縮,反應遲鈍,攝食與進水量明顯下降,肛溫升高,大便稀軟,氣味較臭,小便黃濁,體質(zhì)量增加較為緩慢;藥物組和抑制劑組較模型組的臨床癥狀明顯改善;但抑制劑組的改善程度較藥物組明顯變差。與正常組相比,模型組、藥物組、抑制劑組胃排空率明顯降低(均P<0.05);與模型組相比,藥物組、抑制劑組胃排空率明顯升高(均P<0.05);與藥物組相比,抑制劑組胃排空率明顯降低(均P<0.05),見表1。

表1 各組胃排空率、Hp定植的積分光密度值、LC3陽性細胞的比例、mTOR和LC3相對表達量比較

2.2各組胃黏膜中Hp定植的比較 與正常組相比,模型組、藥物組、抑制劑組Hp定植的積分光密度值明顯升高,定植的Hp菌量明顯增多(均P<0.05);與模型組相比,藥物組、抑制劑組Hp定植的積分光密度值明顯降低,定植的Hp菌量明顯減少(均P<0.05);與藥物組相比,抑制劑組Hp定植的積分光密度值明顯升高,定植的Hp菌量明顯增多(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組胃黏膜上Hp的定植(瑞-姬染色,×400)

2.3各組胃組織的損傷病理變化 HE染色顯示,正常組的胃黏膜全層結(jié)構(gòu)清晰,上皮細胞排列整齊致密,主細胞和壁細胞數(shù)量豐富,胃腺管、胃小凹等清晰可辨,黏膜各層細胞未見炎性浸潤;模型組胃黏膜全層明顯變薄,上皮細胞數(shù)量銳減,部分壁細胞呈現(xiàn)空泡樣變性,胃腺管數(shù)量減少,排列紊亂,黏膜層可見炎性細胞大量浸潤;藥物組胃黏膜全層趨于正常,胃小凹、胃腺管排列趨于正常;抑制劑組胃黏膜的病理損傷較藥物組緩解程度較差,胃小凹間隙增寬,胃腺管排列較為紊亂,見圖2。

圖2 各組胃組織損傷病理(HE染色,×400)

2.4各組胃組織的超微結(jié)構(gòu)損傷變化 正常組胃黏膜細胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰可辨,胞核呈圓形,染色質(zhì)形態(tài)穩(wěn)定,胞質(zhì)中細胞器數(shù)量豐富,線粒體的嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體形態(tài)穩(wěn)定的分布在胞核周圍;模型組胃黏膜主細胞腫脹嚴重,核仁較大,線粒體明顯擴張,嵴結(jié)構(gòu)溶解或消失明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體數(shù)量明顯減少;藥物組胃黏膜超微結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解,線粒體腫脹程度減小,嵴結(jié)構(gòu)損傷減輕;抑制劑組胃黏膜的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯加重,見圖3。

圖3 各組胃組織損傷的超微結(jié)構(gòu)(電鏡,×10 000)

2.5各組胃組織的細胞凋亡 與正常組相比,模型組、藥物組、抑制劑組胃組織中細胞凋亡率明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,藥物組、抑制劑組胃組織中細胞凋亡率明顯降低(均P<0.05);與藥物組相比,抑制劑組胃組織中細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),見表1、圖4。

圖4 各組胃組織細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6各組胃組織中LC3的表達 與正常組相比,模型組、藥物組、抑制劑組胃組織中LC3陽性細胞的比例明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,藥物組、抑制劑組胃組織中LC3陽性細胞的比例明顯下降(均P<0.05);與藥物組相比,抑制劑組胃組織中LC3陽性細胞的比例明顯升高(P<0.05),見表1、圖5。

圖5 各組胃組織中LC3的表達(免疫組化,×400)

2.7小鼠胃組織中mTOR和LC3的表達 將LC3對應的基因ATG4和mTOR輸入依次輸入String數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址:https://string-db.org/)中得到,結(jié)果顯示mTOR和LC3之間存在較為復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,mTOR能調(diào)控LC3表達,見圖6;Western印跡結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組、藥物組、抑制劑組胃組織中mTOR表達明顯降低,LC3表達明顯升高(均P<0.05),與模型組相比,藥物組、抑制劑組胃組織中mTOR表達明顯升高,LC3表達明顯降低(均P<0.05),與藥物組相比,抑制劑組胃組織中mTOR表達明顯降低,LC3表達明顯升高(均P<0.05),見表1、圖7。

圖6 mTOR和LC3的相互作用網(wǎng)絡

圖7 各組胃組織中mTOR和LC3表達

3 討 論

流行病學研究顯示〔10〕,世界上將近50%的人因感染Hp而遭受消化系統(tǒng)疾病的困擾,并且隨著速食主義的興起,Hp感染率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢,如不能控制疾病的蔓延,極易導致潰瘍性胃炎,萎縮性胃炎,腸化生,甚至是癌變等惡性事件的發(fā)生;國際上,世衛(wèi)組織將Hp列為第一類致癌因子〔11〕。Hp感染誘導的胃黏膜損傷的分子機制尚未完全闡明,西醫(yī)藥的治療手段不能使患者免于疾病的困擾。因此深入揭示疾病的病理機制,積極開發(fā)新型、高效的藥物成為該領域?qū)W者急需解決的問題之一。

伴隨歷史的發(fā)展,我國中醫(yī)藥在治療慢性、萎縮性胃炎方面積累了豐富的經(jīng)驗。而Hp相關性胃炎在中醫(yī)中歸為“胃痛”“痞滿”,Hp為外邪入侵,以致機體脾胃正氣不足,濕熱內(nèi)生,因此中醫(yī)從清除濕熱,益陽扶正角度幫助機體更好的抵抗病菌的侵入,增強胃黏膜內(nèi)源性祛邪的能力。譚華梁等〔12〕臨床研究結(jié)果顯示,胃熱舒丸通過健脾理氣,清除燥熱緩解Hp相關性胃炎患者的口苦口臭、惡性等臨床癥狀,顯示了良好的療效,并且不易反復發(fā)作。黃連胃舒湯為我院治療“胃痛”的常用方劑。黃連可瀉除胃火,白芍則能止痛護肝,蒲公英可消腫散結(jié),黃芪則理氣健脾,紫蘇行氣寬中,本方劑能起到健脾護胃、扶正祛邪等效用〔13〕。胃排空率是胃功能監(jiān)測的重要治療,而治療Hp相關性胃炎,最重要的是祛除Hp,減少病菌的定植〔14〕。本研究結(jié)果證實了藥物對疾病的干預作用。

在正常生理條件下,細胞自噬用于清除受損的線粒體,維系細胞的穩(wěn)態(tài)。Feng等〔15〕研究報道在機體處于感染Hp狀態(tài)下,胃黏膜上皮細胞的自噬被過度激活,導致上皮細胞大量凋亡,并且激活相關炎性通路,幫助Hp更好的定植與大面積侵襲。Zhang等〔16〕研究顯示,抑制胃黏膜上皮細胞的自噬行為,緩解Hp相關性胃炎患者的疼痛,減少病菌的定植。mTOR通路是與細胞自噬行為密切相關的通路,是干預自噬相關疾病的可靠治療靶點〔17〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射mTOR-inhibitor后,抑制劑組小鼠的臨床癥狀,胃黏膜病理損傷及超微結(jié)構(gòu)損傷因藥物的改善情況均被逆轉(zhuǎn),證實了藥物對疾病的作用靶點。

綜上,黃連胃舒湯能激活mTOR通路,抑制Hp相關性胃炎脾胃濕熱證模型小鼠的細胞自噬,減輕胃黏膜組織損傷,下調(diào)細胞的凋亡率。但是如何將該方劑推廣至疾病的臨床治療,仍需結(jié)合患者的個體情況及病情進展狀況,進行方劑的加減,確保每位患者獲得滿意的治療效果。