肖新宇 張瑾 李秀華 高艾冬 孫齊美 王天一

(1唐山市工人醫(yī)院麻醉科,河北 唐山 063003;2唐山中心醫(yī)院創(chuàng)傷科)

機械通氣(MV)是急性肺損傷、急性呼吸衰竭、慢性阻塞性肺疾病急性加重期治療時不可或缺的重要手段〔1〕。然而,使用不當時,MV可導致肺和腦部損傷〔2,3〕。據(jù)統(tǒng)計,行MV的ICU患者認知功能障礙或譫妄的發(fā)生率增加〔4,5〕。研究顯示,術(shù)中MV可改變小鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性,并導致小鼠術(shù)后早期認知功能障礙〔6,7〕;即神經(jīng)突觸可塑性的改變參與MV致腦損傷過程。提高海馬突觸可塑性可改善認知功能〔8,9〕。三七總皂苷(PNS)是我國傳統(tǒng)中藥三七的主要活性成分,在心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及物質(zhì)代謝、抗炎抗腫瘤等方面,均有較強的生物活性。近年來,對于PNS神經(jīng)保護作用的研究越來越多,很多學者已經(jīng)證實其對腦神經(jīng)細胞的損傷具有保護作用,并可改善海馬神經(jīng)元突觸可塑性和認知功能障礙〔10～12〕。血塞通注射液(由PNS組成)能有效降低呼吸衰竭MV患者應激性潰瘍發(fā)生率〔13〕;說明PNS可降低MV后的并發(fā)癥,然而PNS是否能減輕MV致腦損傷尚不清楚。故本研究擬通過建立MV致腦損傷大鼠模型,探討PNS對該模型海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1動物 54只SD大鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量(320±20)g,購自深圳市南山區(qū)雅辰長貿(mào)易商行。分籠飼養(yǎng)在可控的環(huán)境中,保持溫度22～24 ℃、濕度(45～55)%、12 h光照/12 h黑暗。實驗獲得醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2主要試劑與儀器 PNS購自廣西梧州制藥(集團)股份有限公司,國藥準字Z20025652,藥品商品名稱:注射用血栓通(凍干),規(guī)格:100 mg/瓶,用時用生理鹽水配制。高爾基染色試劑盒(美國Genmed公司,貨號:GMS80020.3);兔源一抗:突觸后密度蛋白-95(PSD-95,ab238135)、生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43,ab75810)、谷氨酸受體1(GluR1,ab31232)、GAPDH(ab181602)和羊抗兔IgG二抗(ab205718)購自英國Abcam公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)購自上海碧云天生物科技公司;DW3000型小動物人工呼吸機(安徽正華生物儀器設備有限公司);Morris水迷宮實驗裝置(WMT-100S,成都泰盟軟件有限公司);BX61光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3模型制備及分組 將大鼠隨機分為對照(Control)組、MV組、MV+PNS組,每組18只。MV+PNS組于MV前15 min尾靜脈注射PNS 15.844 mg/kg,Control組及MV組于MV前15 min腹腔注射等量生理鹽水。具體操作為〔14〕:所有大鼠稱重后,使用10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,MV過程中每隔1 h使用首劑量的1/3進行維持麻醉。MV組和MV+PNS組麻醉后取仰臥位固定于小動物試驗臺上,脫去頸部毛發(fā),于距胸骨約1 cm處剪開皮膚,暴露氣管,在氣管上做一切口,將自制的大鼠氣管導管(16G型號靜脈留置針導管)插入氣管,連接DW3000型小動物人工呼吸機,參數(shù)設置如下:潮氣量(VT)=40 ml/kg,呼氣末正壓(PEEP)=0 mmHg,吸呼比(I∶E)=1∶2,頻率40次/min,吸入氣體為空氣(氧濃度21%),持續(xù)時間6 h。Control組完成氣管插管操作后進行自主呼吸,未行MV。實驗過程中,大鼠放置于加溫燈下或電熱加熱毯下保持體溫。

1.4Morris水迷宮實驗測量大鼠的認知功能 于MV結(jié)束后1 d,每組取6只大鼠進行Morris水迷宮實驗,將水池分為四個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),在第Ⅳ象限放一隱藏平臺。將大鼠從不同象限放入水中,記錄大鼠找到目標平臺的游泳時間為逃避潛伏期;每天訓練4次,間隔30 min,連續(xù)4 d。第5天撤去平臺,再第Ⅰ象限將大鼠放入水中,記錄90 s內(nèi)大鼠穿過平臺位置的次數(shù)。

1.5HE染色觀察海馬組織病理學變化 每組取6只大鼠,麻醉下處死,取出腦組織標本。冠狀切分為兩部分,一部分-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?另一部分4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,行HE染色,光鏡下觀察海馬組織病理學變化。

1.6高爾基染色觀察海馬神經(jīng)元的樹突棘密度 MV結(jié)束后1 d,每組取剩余的6只大鼠,用0.5%亞硝酸鈉的生理鹽水(現(xiàn)配現(xiàn)用)從左心室灌注,打開右心耳使液體流出(至無血色),再用10%甲醛灌注固定,最后用媒染液(含5%水合氯醛和5%重鉻酸鉀的4%甲醛水溶液)灌注,至流出濃厚橘紅色液體,完成灌流過程。開顱取出腦組織,冠狀切為厚約5 mm的小塊,室溫下用媒染液避光浸泡3 d后,用硝酸銀水溶液(1.5%)避光浸泡3～7 d進行鍍銀。用火棉膠包埋組織塊(1 min)后,切片(50 μm厚),并用2%重鉻酸鉀水溶液浸泡10 min。脫水、二甲苯漂洗10 min,樹膠封片。用油鏡拍照并觀察海馬神經(jīng)元的樹突棘密度,Image-Pro plus軟件計算樹突棘密度(個/10 μm)。

1.7免疫組化法檢測海馬神經(jīng)元突觸后膜α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體GluR1的表達 取1.5制備的腦石蠟切片,修復抗原、封閉后,4 ℃下將切片與一抗GluR1(1∶200)孵育過夜,室溫下再與二抗(1∶200)孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗10 min,經(jīng)脫水、封片后,在顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)GluR1的陽性表達并拍照,分析陽性表達的積分光密度(IOD),每只大鼠取3個視野,計算平均值。

1.8Western印跡檢測海馬組織PSD-95、GAP-43蛋白表達 取-80 ℃保存的海馬組織并提取總蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質(zhì)(30 μg),并轉(zhuǎn)膜。室溫封閉膜1 h后,在4 ℃下將膜與PSD-95(1∶1 000)、GAP-43(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)一抗孵育過夜,室溫下與二抗(1∶4 000)孵育1 h后,顯影。通過Image-Pro plus軟件進行定量分析,β-actin為內(nèi)參。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行One-way ANOVA和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組認知功能變化 與Control組相比,MV組逃避潛伏期顯著延長,穿越平臺所在位置次數(shù)顯著減少(P<0.05);與MV組相比,MV+PNS組3、4 d逃避潛伏期顯著縮短,穿越平臺所在位置次數(shù)顯著增多(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度比較

2.2各組海馬神經(jīng)元病理學變化 Control組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞淡染,細胞核圓形,未見明顯病理損傷;與Control組相比,MV組可見各種組織病理學變化,如核固縮、神經(jīng)元密度減少和神經(jīng)元萎縮。MV+PNS組海馬神經(jīng)元密度增加、神經(jīng)元萎縮得到緩解。見圖1。

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理及GluR1表達(×40)

2.3各組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突棘密度 Control組海馬神經(jīng)元樹突棘較豐富,分布較均勻;與Control組相比,MV組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度顯著減少(P<0.05);與MV組相比,MV+PNS組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度顯著增加(P<0.05)。見表1、圖1。

2.4各組海馬CA1區(qū)GluR1的表達 與Control組相比,MV組海馬CA1區(qū)GluR1陽性表達顯著減少(P<0.05);與MV組相比,MV+PNS組海馬CA1區(qū)GluR1陽性表達顯著增加(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 各組海馬組織PSD-95、GAP-43蛋白表達及CA1區(qū)GluR1陽性表達比較

2.5各組海馬組織PSD-95、GAP-43蛋白表達 與Control組相比,MV組PSD-95、GAP-43蛋白水平降低(P<0.05);與MV組相比,MV+PNS組PSD-95、GAP-43蛋白水平顯著增加(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組海馬組織PSD-95、GAP-43蛋白表達

3 討 論

雖然MV通常是危重患者的救生方法,但它與許多潛在的并發(fā)癥有關(guān)。MV不僅會導致肺損傷,還會導致遠端器官功能障礙,包括大腦。據(jù)報道,接受長期MV的重癥監(jiān)護患者表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能障礙,包括記憶力和認知能力下降,其機制可能與誘發(fā)腦組織炎癥、神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)元突觸可塑性損傷等有關(guān)〔15,16〕。Morris水迷宮實驗是衡量動物空間能力的經(jīng)典實驗,能有效展示動物空間記憶學習能力〔17〕。本研究說明,MV引起大鼠學習和認知功能障礙;而經(jīng)PNS干預的大鼠,其認知功能明顯改善,HE染色也顯示PNS干預組大鼠神經(jīng)元比MV組多,表明PNS對神經(jīng)元具有保護作用。

海馬是一個大腦區(qū)域,參與處理記憶和情緒。海馬體的突觸傳遞和可塑性是學習和記憶不可或缺的因素。海馬體由CA1、CA2、CA3和齒狀回(DG)亞區(qū)組成,對于記憶存儲和檢索很重要。特別是,CA1亞區(qū)構(gòu)成了海馬體的主要輸出,而且CA1微電路中由經(jīng)驗驅(qū)動的突觸變化會影響信息的集成方式。有報道顯示,在成年小鼠中消除CA1錐體神經(jīng)元中的穩(wěn)態(tài)突觸可塑性,可導致空間記憶形成受損。因此,CA1亞區(qū)的錐體神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)突觸可塑性對于認知功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要〔18〕。樹突棘是分布在神經(jīng)元樹突上的小突起,是形成突觸的重要部位,突觸損傷是導致認知障礙的重要原因〔19〕。高爾基染色利用神經(jīng)元的嗜銀性,可以很好地顯示神經(jīng)元的形態(tài)及樹突棘,樹突棘密度可以用來評估突觸的連接性及突觸可塑性變化的過程〔20〕。本研究證實,MV導致大鼠海馬CA1亞區(qū)樹突棘密度降低。

GluR1是突觸后AMPA受體的亞基,參與神經(jīng)傳遞、海馬可塑性和記憶;認知能力下降與海馬表面GluR1表達降低有關(guān)〔21〕。PSD-95是一種參與突觸信號傳遞的關(guān)鍵蛋白,上調(diào)其表達可增加樹突棘的數(shù)量和大小〔22〕。GAP-43是一種在軸突延伸期間誘導的蛋白質(zhì),參與突觸前末梢的形成、突觸可塑性及軸突生長。在發(fā)育過程中,在大多數(shù)神經(jīng)元的軸突延伸中發(fā)現(xiàn)了GAP-43〔23〕。有證據(jù)表明,GAP-43可以直接改變細胞形狀和神經(jīng)突延伸〔24〕。GAP-43和PSD-95是與突觸可塑性相關(guān)的重要分子標記。研究表明,海馬中GAP-43和PSD-95蛋白表達的增加可以抑制認知能力下降〔25,26〕。經(jīng)PNS干預的大鼠海馬中樹突棘密度增加,同時海馬GluR1及GAP-43、PSD-95蛋白表達也明顯增加;提示PNS可能通過增加海馬神經(jīng)元突觸可塑性,減輕MV所致大鼠腦損傷。

綜上,PNS可減輕MV所致大鼠腦損傷,其作用機制可能與增加海馬神經(jīng)元突觸可塑性有關(guān)。此外,有報道稱星形膠質(zhì)細胞為突觸功能的重要參與者,影響突觸連接的重建和突觸傳遞,介導成年海馬體內(nèi)穩(wěn)態(tài)突觸可塑性;而研究顯示MV后在觀察到海馬細胞凋亡和神經(jīng)炎癥增加的同時,血清中星形膠質(zhì)細胞損傷的標志物也較高〔27〕;而星形膠質(zhì)細胞是否參與PNS對MV所致大鼠腦損傷的保護機制,仍需進一步的研究確認。