譚玉婷 宋業(yè)琳 藺亞東 任華風

(1青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院)心血管科,山東 青島 266033;2青島市第五人民醫(yī)院;3青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院)功能檢查科)

心肌細胞缺血再灌注損傷是指缺血心肌在恢復血液再灌注后,加重其結(jié)構(gòu)破壞,引起細胞死亡,致使心肌梗死范圍擴大,造成心臟功能的進一步損害,并影響心肌梗死患者的預后〔1,2〕。有多篇報道指出〔3～5〕,由于活性氧產(chǎn)生的過多或抗氧化酶活性減低,則可引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應,損傷細胞膜并進而使細胞死亡,從而加重了心肌受損。雖然早期進行再灌注治療可恢復相關(guān)血管的功能,并避免心肌壞死的發(fā)生,但原病灶處已出現(xiàn)相應的病變,尤其是心肌收縮功能及血管內(nèi)皮功能等一系列損傷性變化,在行心肌再灌注治療后表現(xiàn)得更為明顯,有發(fā)生心律失常甚至猝死的風險。本研究探究基于MAPK通路探究下調(diào)微小RNA-15b(miR-15b)對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物:48只大鼠購自河南祺祥科技生物有限公司〔SYXK(豫)2021-0001〕,體質(zhì)量250～310 g,平均(266.00±28.50)g,光照12 h/d,喂養(yǎng)大鼠1 w,本研究由醫(yī)院倫理委員會進行批準通過。主要試劑:miR-15b(試劑盒:艾美捷科技有限公司,abx096787);腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司);白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,70-EK106/2-96);丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(北京義翹神州科技股份有限公司,RG80464-ACG)、超氧化物歧化酶(SOD,北京伊塔生物科技有限公司,SY6458);絲裂原活化蛋白激酶(MAPK,上海烜雅生物科技有限公司,P1024);p-p38(上海廣銳生物科技有限公司,ET3469);磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK,上海梵態(tài)生物科技有限公司,FT-D24084)。

1.2慢病毒載體構(gòu)建 miR-15b表達下調(diào)的慢病毒載體構(gòu)建,重組miR-15b下調(diào)病毒載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1)并經(jīng)測序驗證,病毒滴度為108 TU/ml,制備完成將重組慢病毒載體在-80 ℃保存。

1.3分組及建模 將事先購買并喂養(yǎng)1 w的大鼠分為4組,其中12只作為空白組大鼠不做處理,其余3組依據(jù)王玉梅等〔6〕研究實驗大鼠。構(gòu)建方法:確保每只大鼠均禁食超過12 h,注射10%水合氯醛進行麻醉處理,麻醉生效后將其固定在夾板上,連接呼吸機及心電圖進行實時監(jiān)測生理狀況,在大鼠胸部左側(cè)3～4肋間處剪開其皮膚并分離各層肌肉并露出肋骨,持剪刀剪開第3、4根肋骨,并拉開胸壁,暴露其心臟,用止血鉗將胸腺夾住,將左心耳與肺動脈圓錐間穿7-0絲線。缺血再灌注組麻醉后開胸,斷3～4肋,打開心包膜,暴露心臟,于冠狀動脈左前降支根部穿線(0號縫合線),結(jié)扎阻斷血流,根據(jù)心電圖ST段抬高情況判定阻斷成功后30 min解除阻斷,根據(jù)心電圖ST的回落情況判定實現(xiàn)再灌注,縫合胸壁,大鼠恢復自主呼吸。

1.4miR-15b表達量 采集所有大鼠心肌組織,2 000 r/min 4 ℃離心10 min。miRNA采用mirVana PARIS Kit試劑盒提取純化。離心后收集miRNA。miR-15b上游引物:5′-ACGGTCGAGCTTAGA-AG-3′,下游:5′-GCTGTTTGTCTGGCTGCTGCTCCG-3′。U6上游引物:5′-CTGGGTCGAAACGCTCGTCT-3′,下游:5′-CAGTGCGACTAGAGCCACTAG-3′。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 205 s,共進行40個循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計算出miR-15b表達量。

1.5IL-6、TNF-α、MDA、SOD水平檢測 抽取大鼠清晨尾部血2 ml,離心處理10 min,分離出的上層血清,在-45 ℃環(huán)境下保存,采用ELISA檢測IL-6、TNF-α、MDA、SOD;首先在酶標板上進行標記,并配制稀釋標準品。取100 μl血清樣品及標準品放入反應孔上,孵育32 min,使用洗滌液清洗3次酶標板,加入100 μl酶標工作液,避光孵育32 min,使用洗滌液清洗3次酶標板,加入100 μl的3,3′,5,′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,避光孵育12 min,顯色后加入終止液,450 nm處測吸光值,顏色深淺與IL-6、TNF-α、MDA、SOD呈正比,經(jīng)繪制標準曲線計算IL-6、TNF-α、MDA、SOD。

1.6病理組織學觀察 各組大鼠腹腔注射80 mg/kg的3.0%戊巴比妥麻醉,迅速取分離心肌組織,將提取的心肌組織制作成標本,用4%多聚甲醛固定,室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋,作3 μm的切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色處理,使用光學顯微鏡觀察大鼠病理變化。

1.7MAPK信號通路 采用Western印跡檢測,取所有心肌細胞缺血再灌注損傷大鼠心肌組織蛋白。提取50 μg蛋白,把5×蛋白緩沖液注入4∶1的體積中。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔IgG,孵育60 min室溫水平搖床,洗滌5次Westem洗滌液,每10 min 1次。經(jīng)過電化學發(fā)光(ECL)顯色和曝光后,進行BIO-RAD成像,檢測條帶的灰度值,分析統(tǒng)計結(jié)果。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學觀察 空白組心臟組織結(jié)構(gòu)正常,且心肌細胞排列整齊,未見心肌細胞肥大、變性,橫紋清晰。模型組心肌細胞腫脹,且少數(shù)心肌細胞溶解壞死,部分心肌細胞質(zhì)疏松。上調(diào)組部分心肌細胞核增大,部分血管周圍心肌細胞溶解壞死,且心肌間質(zhì)可見灶狀炎細胞浸潤。下調(diào)組心肌細胞橫紋變淺,心肌間質(zhì)未見明顯急性慢性炎細胞浸潤及纖維細胞增生。見圖1。

圖1 各組心臟組織病理(HE染色,×400)

2.2各組miR-15b表達量比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組miR-15b表達量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組miR-15b表達量明顯升高,下調(diào)組miR-15b表達量明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組miR-15b表達量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-15b表達、炎癥反應、氧化應激反應、心功能指標比較

2.3各組炎癥反應情況對比 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組IL-6、TNF-α表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組IL-6、TNF-α表達水平明顯升高,下調(diào)組IL-6、TNF-α表達水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組IL-6、TNF-α表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組氧化應激情況對比 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組MDA、SOD表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組MDA、SOD表達水平明顯升高,下調(diào)組MDA、SOD表達水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組MDA、SOD表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.5各組心功能指標比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組LVEDP表達水平升高,LVSP表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組LVEDP表達水平升高,LVSP表達水平降低;下調(diào)組LVEDP表達水平降低,LVSP表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組LVEDP表達水平降低,LVSP表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.6各組MAPK信號通路表達量比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達水平明顯升高,下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組MAPK信號通路表達量比較

圖2 Western印跡檢測各組MAPK信號通路蛋白

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指急性心肌梗死后,冠狀動脈出現(xiàn)阻塞,甚至部分阻塞,經(jīng)治療后血管再通,血管損傷呈短暫加重的病理生理現(xiàn)象〔7〕。由于血液再灌注,心肌細胞在缺血期保持存活,而于再灌注期最終死亡〔8〕。目前認為心肌再灌注損傷中再灌注性心律失常,屬于可逆性損傷,但是有潛在的致命性。

miRNAs屬于短小內(nèi)源性單鏈非編碼RNA片段,其片段長度約為22個核苷酸,現(xiàn)已被證實為能夠?qū)毎鸬揭欢ㄕ{(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子〔9〕。有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示〔10〕,miRNAs主要通過自身能夠形成miRNA誘導的下調(diào)復合物的機制在機體內(nèi)發(fā)生相關(guān)因子作用。因此,miRNAs在機體各處細胞內(nèi)均存在著一定的細胞生理活動,如對各種疾病的生長凋亡情況起到調(diào)控作用,近些年,miRNAs引起了相關(guān)學界專家對其廣泛的關(guān)注〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn),miR-15b密切參與了調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)、血管生成、心肌肥大、再灌注損傷等病理生理過程,由此可分析,miR-15b在機體內(nèi)可能屬于較為關(guān)鍵性且起到調(diào)節(jié)作用的因子之一。近年研究報道中指出〔12〕,機體正常狀態(tài)下的心肌組織中存在者兩百余種miRNAs表達,當機體異常狀態(tài),心肌組織異常應激狀態(tài)時,miRNAs表達會產(chǎn)生相應的改變,其中miR-15b被認為與心肌組織應激狀態(tài)的改變有直接性的關(guān)系,尤其是體現(xiàn)在心肌缺血再灌注狀態(tài)下的機體中,miR-15b的相對表達量的變化更加顯著,提示miR-15b可能存在著一定的調(diào)控及促進作用,由此得知,miR-15b可能對心肌細胞缺血再灌注損傷進行參與調(diào)節(jié)〔13〕。另有研究報道〔14〕,miR-15b家族在正常大鼠心肌細胞中呈現(xiàn)高表達,表達強度極高,當大鼠體內(nèi)出現(xiàn)缺血再灌注損傷情況時,會對某些miR-15b家族的成員造成影響。本研究結(jié)果提示,miR-15b在心肌再灌注損傷的發(fā)展中起到關(guān)鍵性的作用。另有學者在文章中認為〔15〕,機體中廣泛存在的miR-15b家族能夠參與細胞的各種生理活動中,并起到一定的調(diào)節(jié)作用,與多種疾病及腫瘤的發(fā)生有關(guān)。經(jīng)本研究結(jié)果推測,miR-15b可能在心肌細胞缺血再灌注損傷誘導的凋亡的過程中進行參與和調(diào)節(jié),該過程信號轉(zhuǎn)導機制有待進一步研究,為防止再灌注損傷及細胞凋亡率的降低,提供一定切實可行的理論基礎(chǔ)。

心肌細胞缺血再灌注的形成是一個極其復雜的過程,其發(fā)生機制包括應激反應及炎癥反應發(fā)生改變等造成機體相關(guān)功能紊亂,對心膜通透性造成極大的損傷,導致心肌細胞缺血再灌注的發(fā)生〔16〕。經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn),MDA水平與細胞損傷程度之間存在一定聯(lián)系,SOD活性程度能夠?qū)C體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化能力進行一定程度的反映。MDA、SOD水平的降低能夠改善機體氧化應激狀態(tài),提升機體自由基清除能力〔17〕。IL-6、TNF-α與炎性反應及心肌細胞缺血再灌注損傷密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)研究指出,IL-6、TNF-α是對心臟術(shù)后所產(chǎn)生的各種并發(fā)癥的嚴重程度進行衡量的重要指標〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn),在心肌細胞缺血再灌注損傷后,促炎性細胞因子水平的升高增加了心肌損傷,使促炎性細胞因子釋放增多從而形成惡循環(huán)。本研究結(jié)果顯示,通過對miR-15b表達水平進行下調(diào),能夠及時終止惡性循環(huán),以此來改善大鼠的LVEDP、LVSP水平,對心肌功能起到一定保護作用。

MAPK信號通路在機體內(nèi)屬于較為關(guān)鍵重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),涉及細胞的生長及發(fā)育,與炎癥及腫瘤、心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān),調(diào)控MAPK信號通路可降低心肌缺血程度及梗死程度,改善心功能及炎癥反應〔19～21〕。本研究說明,在疾病發(fā)病機制中MAPK信號通路在其中起到關(guān)鍵性作用,通過下調(diào)miR-15b表達可減少心肌細胞損傷、可達到抗炎效果,不僅對于損傷有抑制作用,還可起到改善預后的作用,很可能作為治療心肌細胞缺血再灌注損傷的治療靶點,但關(guān)于MAPK信號通路在心肌細胞缺血再灌注損傷中表達及作用機制的研究,目前研究尚少。