李明霞 楊謙 趙軼峰 張冰潔 王曉芳 趙婷 趙鐵軍

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 1內分泌科,河北 張家口 075000;2胃腸腫瘤外科;3張家口第一醫(yī)院中醫(yī)內科;4河北北方學院醫(yī)學生物化學)

糖尿病腎病是糖尿病患者最重要的并發(fā)癥之一。我國的發(fā)病率亦呈上升趨勢,目前已成為終末期腎臟病的第二位原因,僅次于各種腎小球腎炎〔1,2〕。糖尿病腎病過程中伴隨著足細胞的損傷,足細胞附著于腎小球基底膜的外側,連同血管內皮細胞和腎小球基膜一起構成了腎小球血液濾過屏障〔3,4〕。趨化因子及其受體在急慢性糖尿病腎病的發(fā)病機制中起著重要作用,趨化因子受體(CXCR)3參與了足細胞在高糖下的炎癥因子釋放、組細胞損傷等重要過程〔5,6〕,本研究將通過沉默CXCR3探究CXCR3對組細胞的凋亡與自噬的影響,同時探究哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖體S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信號通路在此過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1細胞來源 小鼠腎足組細胞MPC-5細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2主要試劑 RPMI1640、胎牛血清和青鏈霉素購于Gibco;細胞培養(yǎng)皿、離心管等實驗耗材購自美國Corning公司;LipofectamineTM2000 轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司;si-CXCR3、si-NC載體、由上海吉瑪制藥技術有限公司合成;噻唑藍(MTT)細胞活力檢測試劑盒購自奧淇洛譜生物科技有限公司;抗Bcl-2抗體(ab182858)、抗半胱天冬氨酸蛋白激酶(Caspase)-3抗體(ab184787)、抗mTOR(ab134903)、抗S6K1抗體(ab32529)、抗S6K1(phospho S424)抗體(ab47379)、抗GAPDH抗體(ab8245)及二抗購于美國Abcam公司。

1.3儀器設備 Allegra X-22R臺式高速冷凍離心機(貝克曼公司,德國),4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司),-80 ℃超低溫冰箱、Applied Biosystems 7500fast qPCR 儀、Multiskan SkyHigh全波長酶標儀(美國 Thermo 公司), Labsystems Multiskan352酶標儀(美國MS公司),DM-BA400-B 顯微鏡(美國Motic 公司), Western印跡電泳儀(北京市六一儀器廠),M3600蛋白質掃描儀(清華紫光),Attune NxT流式細胞儀(美國BD公司)。

1.4細胞培養(yǎng)及轉染條件 小鼠腎足組細胞MPC-5細胞培養(yǎng)條件:未分化的小鼠腎足細胞使用10%胎牛血清 (FBS)、1%青霉素-鏈霉素及10 U/ml小鼠重組干擾素γ(γ-IFN)的RPMI1640培養(yǎng),置于33 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。誘導分化時,將小鼠腎足細胞轉移至37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中,使用無γ-IFN,含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d。對分化成熟的足細胞分為4組,模型組、NC組和si-CXCR3組分別予以30 mmol/L葡萄糖進行高糖刺激48 h,對照組以5.5 mmol/L葡萄糖刺激。細胞轉染采用脂質體轉染按照 LipofectamineTM2000說明書進行轉染,8 h后換液,去除LipofectamineTM2000,更換為完全培養(yǎng)基5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)〔7〕。

1.5小鼠腎足組細胞mRNA表達水平檢測 在低溫及無酶環(huán)境中采用TRizol提取mRNA后,按照試劑盒進行在冰上進行cDNA反轉錄,反轉錄進行qPCR,擴增條件:95 ℃ 預變性10 min,95 ℃ 變性10 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 20 s,共35個循環(huán)。以通過溶解曲線和2-△△Ct計算mRNA相對表達量,試驗中采用的引物順序:ATG5上游引物:5′-CAAGATGATCTGCCTGCTGACT-3′,下游:5′-ATGTCCGTGGAGTGCCTGA-3′;ATG7上游引物:5′-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游:5′-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′;Beclin-1上游引物:5′-ACTTCGCCTGTCAGTCATA-3′,下游:5′-GGTGAGGCAGGGTCCT-3′;CXCR3上游引物:5′-GACTCAAAGCCACCTCATTC-3′,下游:5′-GCCTTGCCTTCCTAAATACC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCCTACCTCCCTCGAAAG-3′,下游:5′-CAGACAGCCAGATAGACGGAC-3′。

1.6MTT法檢測小鼠腎足組細胞MPC-5細胞活力 按照細胞密度為1×104/ml對細胞密度進行調整并將細胞懸液并接種于96孔板中,按照實驗分組處理后,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。每孔加入10 μl MTT工作液于培養(yǎng)箱孵育3 h,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)后將6孔板置于搖床上低速震蕩15 min,震蕩晶物溶解后選擇490 nm波長,于酶標儀上測定各孔吸光度(OD)值,細胞存活率的計算方式為:細胞存活率 =(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD),每組設置3個復孔〔9〕。

1.7細胞凋亡實驗 將各組MPC-5 細胞培養(yǎng)48 h,將6孔板用PBS 洗滌2遍,胰酶消化后收集全部細胞,重懸細胞并加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V和碘化丙啶(PI)混勻,所有操作在冰上完成并避光孵育20 min,流式細胞儀進行細胞凋亡分析〔10〕。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 將各組細胞用RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞總蛋白,冰浴30 min后,12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min,取上清液測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液,95 ℃金屬浴煮沸,12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min,取上清液。將總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)80 V 15 min,120 V 2 h,與聚偏氟乙烯(PVDF)膜120 V 2.5 h轉膜,TBST漂洗3次,每次5 min,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST漂洗3次,每次5 min,按照各抗體說明對抗體進行稀釋(1∶500～1∶5 000)加入一抗,4 ℃冰箱孵育過夜,TBST漂洗3次,每次5 min,羊抗兔二抗室溫孵育2 h,TBST漂洗3次,每次5 min,電化學發(fā)光(ECL)顯色,發(fā)光儀曝光、拍照并進行定量分析〔11〕。

1.9統(tǒng)計學處理 實驗獨立重復3次,采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組細胞CXCR3 mRNA表達水平 與對照組相比,模型組和si-NC組細胞CXCR3 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組細胞CXCR3 mRNA表達量顯著降低,并且顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞CXCR3 mRNA表達水平、細胞活力、細胞凋亡及凋亡蛋白相對表達水平比較

2.2si-CXCR3對腎足組細胞MPC-5細胞活力的影響 與對照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3組腎足細胞活力顯著降低,并且隨著時間的增長,活力進一步下降(P<0.05,P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細胞活力顯著提升(P<0.05)。見表1。

2.3si-CXCR3對腎足細胞MPC-5細胞凋亡的影響 與對照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3小鼠腎足細胞凋亡顯著增加(P<0.05,P<0.01),與模型組、si-NC組相比,si-CXCR3組小鼠腎足細胞凋亡顯著降低(P<0.01)。與對照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3組腎足細胞Bax和Caspase3蛋白表達顯著增加(P<0.05,P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細胞Bax和Caspase3蛋白表達顯著降低(P<0.01),與對照組相比,模型組和si-NC組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4si-CXCR3對腎足組細胞炎癥因子分泌的影響 與對照組相比,模型組、si-NC組、si-CXCR3組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型組、si-NC組比較,si-CXCR3組上述指標明顯降低,但仍顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 si-CXCR3對各組腎足組細胞炎癥因子分泌及自噬相關分析mRNA及蛋白表達、mTOR/S6K1信號通路的影響

2.5si-CXCR3對腎足組細胞自噬的影響 與對照組相比,模型組和si-NC組Beclin1、ATG5和ATG7 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組、Beclin1、ATG5和ATG7 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.6si-CXCR3對腎足組細胞mTOR/S6K1信號通路的影響 與對照組相比,模型組和si-NC組腎足細胞mTOR/S6K1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組mTOR/S6K1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,模型組和si-NC組腎足細胞S6K1蛋白磷酸化修飾顯著升高(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組S6K1蛋白磷酸化修飾降低(P<0.05),并且與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

3 討 論

糖尿病腎病是一種主要的長期糖尿病微血管病變,可并發(fā)1型和2型糖尿病及其他繼發(fā)性糖尿病,包括移植后糖尿病。在糖尿病腎病的發(fā)展過程中,有3種主要的細胞內代謝異常途徑:多元醇和PKC途徑的激活;晚期糖基化終產物的形成;腎小球濾過過度引起的腎小球內高血壓。在這3條主要途徑的上游,高血糖是糖尿病腎病進展為末期腎病(ESRD)的主要驅動力,此過程中最好的預防策略是使用匹配良好的供體并進行量身定制的免疫抑制(使用較少的致糖尿病藥物和可能的無類固醇方案)和生活方式的改變,嚴格的血糖控制,早期引入血管緊張素轉換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑及可能轉換為不致糖尿病的治療方案,有助于延緩糖尿病腎病的進展〔12,13〕。

足細胞與腎病綜合征中的蛋白尿與腎小球的機械性功能障礙有關,涉及足細胞上皮細胞的功能,包括足細胞足突的消失,因此腎小球足細胞是腎臟研究的重要靶點之一〔14〕。研究表明從多能干細胞中建立的腎臟類器官已經能夠對人類足細胞的發(fā)育和疾病進行詳細的分析,類器官中的足細胞表達相關基因和蛋白質,并表現(xiàn)出特征性的形態(tài),尤其是在實驗性移植中〔15〕。當前有研究通過分析糖尿病及糖尿病合并早期腎損傷患者外周血清趨化因子CXCR3及其配體MIG,IP-10的表達水平,證實CXCR3,MIG,IP-10表達水平與糖尿病早期腎損傷發(fā)生具有一定的關系,可一定程度上反映2型糖尿病腎臟損傷的嚴重程度〔16〕,本研究提示,出沉默CXCR3可通過抑制炎癥因子釋放的途徑發(fā)揮腎足細胞的保護作用。

自噬是可清除蛋白質聚集體和受損細胞器以維持細胞內穩(wěn)態(tài),是重要的應激反應機制,參與多種疾病的發(fā)病過程,在糖尿病條件下失調的自噬可能導致腎小球和腎小管間質病變〔17〕。本研究提示,出沉默CXCR3可以糾正失調的自噬,自噬是一種正常的生理過程,在體內平衡和萎縮中較為活躍,由于本研究同時證實了沉默CXCR3后細胞凋亡水平顯著降低,這側面證實了凋亡傾向和自噬傾向之間的復雜調控關系,在特殊細胞內環(huán)境下自噬構成了一種應激適應,可以避免細胞死亡,并抑制凋亡,而在其他細胞環(huán)境中,自噬構成了一種替代性細胞死亡途徑〔18〕?；诒狙芯繉τ诘蛲龊妥允傻慕Y果推測沉默CXCR3可以通過增強自噬作用清除細胞中受損的蛋白質和細胞器,來促進維持體內穩(wěn)態(tài),從而降低組細胞的損傷和凋亡。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是細胞代謝的主要調節(jié)因子,mTOR通過多種信號調節(jié)細胞的生長和增殖,其信號通路在許多人類疾病中被解除調控〔19〕。mTOR在調節(jié)自噬中也起著重要作用,當細胞受到應急信號時誘導自噬消除了這些應激引起的損傷,當應激解除時,自噬恢復到正常水平,此過程伴隨著凋亡的增加和凋亡的減少,以及mTOR信號通路的調控〔20〕。本研究表明,高糖刺激后的小鼠腎足細胞MPC-5會出現(xiàn)顯著高表達mTOR和S6K1蛋白,因此可以顯著抑制自噬蛋白分子的表達,從而抑制自噬,誘導凋亡,而沉默CXCR3可以下調mTOR及S6K1蛋白的表達,從而糾正異常的自噬,增加自噬作用,清除細胞中受損的蛋白質和細胞器,從新恢復細胞內穩(wěn)態(tài),發(fā)揮對自噬的調控作用。同時,此過程中伴隨著mTOR/S6K1信號通路的磷酸化修飾調控,高糖刺激后的小鼠腎足細胞MPC-5會出現(xiàn)顯著高表達磷酸化的S6K1蛋白,而沉默CXCR3后,這種磷酸化蛋白表達顯著降低。