姚曉媛 鐘志偉 宋曉環(huán) 王忠超

(1長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,吉林 長春 130031;2吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院)

胃癌(GC)在我國發(fā)生很廣泛,據(jù)估計,全世界2020年GC的發(fā)病例數(shù)達1 089 103例,在總癌癥中發(fā)病占5.6%,位居第5位,占全球癌癥總死亡率7.7%,位居第4位〔1〕。目前,研究人員對于胃癌的研究越來越廣泛,同時手術(shù)切除、化學(xué)藥物治療、放射性同位素治療等治療技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于胃癌患者的治療〔2〕。但是,傳統(tǒng)的治療方法或多或少都會存在一定副作用,所以尋找一種新的治療方法來減少傳統(tǒng)治療對患者的副作用,改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量十分必要。玻璃酸鈉即透明質(zhì)酸鈉,屬于一類天然高分子線性黏多糖,在人體的細胞間質(zhì)內(nèi)廣泛分布,臨床上主要用于術(shù)后防粘連、骨關(guān)節(jié)炎潤滑等〔3〕,而玻璃酸鈉在腫瘤中的作用研究甚少,前期研究證明高分子量玻璃酸鈉能夠抑制表皮生長因子(EGF)介導(dǎo)的胃癌細胞增殖、遷移,并可以使EGF受體酪氨酸激酶(TK)的激活被阻斷,進而抑制細胞內(nèi)EGF介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路等主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,提示玻璃酸鈉對TK具有抑制作用〔4〕。c-Met為肝細胞生長因子(HGF)的受體,屬于TK受體(PTK)家族,擁有TK活性,可對細胞增殖、運動與分化施以刺激〔5〕。因此,若c-Met磷酸化能被抑制便可阻止腫瘤細胞增殖。本研究探討玻璃酸鈉對c-Met介導(dǎo)的人GC AGS細胞增殖的抑制效應(yīng)及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 GC細胞系A(chǔ)GS由上海細胞生物研究所提供,HGF為派普泰克亞洲分公司生產(chǎn),胎牛血清(FBS)與高糖DMEM皆為上海玉博生物公司產(chǎn)品,抗體p-c-Met酪氨酸(Tyr)1234、p-Akt (Thr308)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)液酶(p-ERK)1/2(Thr202/Tyr204)、p-PI3K與磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-MEK)1/2 (Ser217/221)均為南京巴傲得公司生產(chǎn),CVTK試劑盒為上海銳賽生物公司生產(chǎn),玻璃酸鈉為山東福瑞達有限公司生產(chǎn)。

1.2GC細胞培養(yǎng) AGS置于內(nèi)含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。DMEM培養(yǎng)液每48 h更換1次,細胞傳代用0.25%胰蛋白酶。

1.3細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CVTK)檢測細胞增殖 96孔培養(yǎng)板上接種對數(shù)生長期的AGS細胞,實驗分為:空白對照(Control)組、HGF組、玻璃酸鈉(500 μg/ml SH)+HGF組、玻璃酸鈉(1 000 μg/ml SH)+HGF組,細胞培養(yǎng)0.5 d后,把培養(yǎng)液替換成無血清成分的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,然后加入不同濃度玻璃酸鈉 1 h,再以HGF作用24 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃避光孵育30 min后,在酶標(biāo)儀上測OD值(波長450 nm)。每組3個復(fù)孔,相同條件下實驗重復(fù)3次。

1.4Western印跡 取對數(shù)生長期的AGS細胞,消化并接種于6孔板中,12 h后,加入不同濃度的玻璃酸鈉,并以HGF生長因子刺激,培養(yǎng)24 h。細胞處理后,提取蛋白。制膠,加入樣品進行電泳分離蛋白,然后4 ℃、350 mA、轉(zhuǎn)膜2 h,封閉1 h,加入相應(yīng)的一抗室溫2 h或4 ℃過夜,洗滌,室溫孵育二抗1 h,再次洗滌,在成像系統(tǒng)下加入發(fā)光試劑掃描。Western印跡測定c-Met Tyr1234位點磷酸化(p)-c-Met-Y1234、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT相對蛋白表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1玻璃酸鈉抑制由HGF/c-Met介導(dǎo)的AGS細胞增殖活動 相比于Control組,細胞增殖活性于HGF(50 ng/ml,12 h)處理后明顯提高(P<0.05),而加入不同濃度的玻璃酸鈉后;與HGF組相比,細胞增殖能力明顯降低(P<0.05),提示玻璃酸鈉能有效抑制HGF誘導(dǎo)的細胞增殖,見表1。

表1 各組GC細胞增殖能力及細胞中p-c-Met(Y1234)、p-MEK1/2 (S217/221)、p-ERK1/2 (T202/Y204)、p-PI3K、p-AKT相對蛋白表達比較

2.2玻璃酸鈉阻斷HGF誘導(dǎo)的AGS細胞c-Met酪氨酸1234位點磷酸化 HGF作用使AGS細胞內(nèi)p-c-Met(Y1234)水平明顯升高(P<0.05),而以500、1 000 μg/ml的玻璃酸鈉溶液作用后,細胞內(nèi)p-c-Met(Y1234)水平明顯降低(P<0.05),表明玻璃酸鈉溶液可以有效地抑制HGF引起的c-Met(Y1234)的磷酸化,見表1、圖1。

1～4:Control組、HGF組、500 μg/ml SH+HGF組、1 000 μg/ml SH+HGF組圖1 Western印跡檢測各組胃癌細胞中p-c-Met(Y1234)、p-MEK1/2 (S217/221)、p-ERK1/2 (T202/Y204)、p-PI3K、p-AKT相對蛋白表達

2.3玻璃酸鈉抑制AGS細胞HGF/c-Met-MAPK/ERK通路中MEK1/2、ERK磷酸化 與Control組相比,HGF可使MEK、ERK磷酸化水平明顯增加(P<0.05),而不同濃度的玻璃酸鈉能使其水平明顯降低(P<0.05),見表1、圖1。

2.4玻璃酸鈉抑制AGS細胞HGF/c-Met-PI3K/AKT通路中PI3K、AKT的磷酸化 與Control組比較,HGF刺激之后可使PI3K、AKT磷酸化水平明顯增加(P<0.05),而不同濃度的玻璃酸鈉能明顯抑制HGF的這一作用(P<0.05),見表1、圖1。

3 討 論

HGF/c-Met 通路在各類細胞內(nèi)分布廣泛,為各條信號途徑的起始點,在諸多組織器官的生長發(fā)育中起關(guān)鍵性生理調(diào)控效能〔6〕。HGF與c-Met結(jié)合后可引起一系列酶促反應(yīng)發(fā)生,進而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移及有絲分裂等多個過程〔7,8〕。激活態(tài)c-Met是信號途徑MAPK/ERK、PI3K/Akt等激活的前提,HGF結(jié)合c-Met可導(dǎo)致c-Met細胞中Tyr殘基發(fā)生磷酸化,對結(jié)構(gòu)域內(nèi)2個Tyr殘基Y1234與Y1235的自身磷酸化施以催化作用,在激活c-Met酪氨酸激酶方面發(fā)揮重要作用〔9,10〕。c-Met上Y1234/Y1235磷酸化后會使β鏈C 末端分布的Tyr1349與Tyr1356發(fā)生磷酸化,隨后下游信號分子的多功能對接位點(MDS)暴露,PI3K、生長因子受體結(jié)合蛋白(Grb)-2、Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白(Gab)1等積聚于MDS區(qū)域,同時迅速磷酸化,由此將信號通路MAPK、PI3K/AKT等激活,導(dǎo)致細胞發(fā)生分裂增殖,對細胞遷移、存活施以調(diào)節(jié),在若干生理病理活動中起到一定參與作用〔11,12〕。所以,對HGF激活c-Met行為進行阻斷,極大有助于削弱腫瘤細胞的遷移與增殖,促進腫瘤細胞凋亡,本實驗結(jié)果表明,玻璃酸鈉可以阻斷HGF對c-Met的激活。

腫瘤細胞的增殖活動與MAPK/ERK和PI3K/AKT介導(dǎo)的細胞信號通路密切相關(guān)〔13,14〕,這些通路被各種刺激因子(如生長因子)激活后,信號逐級傳遞活化下游轉(zhuǎn)錄因子,由此調(diào)控相關(guān)蛋白表達,釋放調(diào)控細胞增殖分化等諸多效能。在癌癥進行期間,腫瘤持續(xù)擴大的致因主要是癌細胞的不斷生長〔15〕。研究表明,HGF在多種腫瘤細胞中高表達,并通過調(diào)控MAPK/ERK等信號通路使細胞持續(xù)增殖〔16〕。本課題組前期實驗結(jié)果顯示,玻璃酸鈉能夠有效削弱由EGF介導(dǎo)的AGS細胞的增殖行為〔17〕,同時玻璃酸鈉對EGF/EGFR介導(dǎo)的MAPK/ERK、PI3K/AKT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程具有抑制作用,而c-Met作為PTK家族之一,同樣可介導(dǎo)MAPK/ERK及PI3K/AKT信號通路〔18〕。c-Met是MAPK/ERK、PI3K/AKT信號通路的起始點〔19〕,HGF與c-Met受體結(jié)合后,c-Met自身的酪氨酸(Tyrl235和Tyrl234)發(fā)生磷酸化,進而激活兩條信號通路中關(guān)鍵分子。本研究中,不同濃度玻璃酸鈉對由HGF介導(dǎo)的AGS細胞增殖活動存在明顯的抑制效能。同時證實不同濃度玻璃酸鈉對HGF啟動的MAPK/ERK、PI3K/Akt通路均具有抑制作用,進一步表明玻璃酸鈉可抑制癌細胞的增殖活動,進而影響腫瘤的生長。

綜上,玻璃酸鈉通過阻斷HGF誘導(dǎo)的c-Met自身磷酸化,由此對HGF/c-Met主導(dǎo)的增殖有關(guān)的信號途徑進行抑制,最終抑制AGS增殖,由此釋放抗腫瘤效能。